[發明專利]遺傳性血管水腫的檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201410768922.7
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN105527419A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 白彩明
• 申請（專利權）人: 北京新華聯協和藥業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種遺傳性血管水腫的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒包括：包被抗人C1-INH抗體的載體、生物素標記的C1-INH校準品、 鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化酶試劑、化學發光底物液A和B以及洗 滌液。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述載體為化學 發光板或磁珠微粒。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人 C1-INH抗體選自鼠抗人C1-INH單克隆抗體、兔抗人C1-INH多克隆抗 體、羊抗人C1-INH的多克隆抗體、雞抗人C1-INH多克隆抗體中的一 種或多種。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人C1-INH 抗體選自鼠抗人C1-INH單克隆抗體。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述鼠抗人 C1-INH單克隆抗體的純度不小于95％，濃度不小于1mg/mL。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人C1-INH 抗體濃度為5μg/mL。

7.權利要求1-6任一項所述的試劑盒的制備方法，其特征在于： 包括以下步驟：

(1)包被抗人C1-INH抗體的載體的制備：

包被抗人C1INH抗體的96孔化學發光板：將包被用抗人C1-INH 抗體加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加入微孔板內，每孔100μL，包被濃 度1～5μg/mL，4℃過夜，用含Tween20的磷酸鹽緩沖液洗滌微孔板 2遍后，再加入含有BSA的磷酸鹽緩沖液，室溫靜置2小時后，棄 去孔內液體，徹底干燥發光板，于鋁箔袋真空包裝，放2-8℃保存；

或包被抗人C1-INH抗體的磁珠微粒：將直徑0.15μm的磁珠微 粒用戊二醛活化，室溫混勻2～5小時候，用0.01mol/LPBS緩沖液 沖洗4次，并將該溶液進行懸浮，濃度為0.1mg/mL～2.5mg/mL；然 后，每毫升懸液中加入抗人C1-INH抗體10μg，于20～40℃混勻孵 育3～10小時；用等體積的0.01MPBS2％～5％BSApH7.0～7.4緩沖 液于20～40℃孵育2～8小時；最后，用2％BSA0.01～0.1MTris-HCl pH7.5～pH9.0緩沖液清洗三次，并用該溶液配制成磁珠微粒濃度 0.1～1.0mg/mL，即得；

(2)生物素標記的C1-INH校準品的制備：將C1-INH用0.1 mol/L，pH8.0的碳酸氫鈉緩沖液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸緩沖液 稀釋到1mg/mL，并用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L，pH8.6的硼酸緩沖液，對蛋白質充分透析；用1mLDMSO溶 解NHSB1mg；向1mLC1-INH溶液加入120μlNHSB溶液；在室溫 下持續攪拌，保溫2-4小時；加入9.6μL1mol/LNH₄Cl，在室溫下攪 拌10分鐘；在4℃，對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣 品上1mL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1mL/管，蛋白質在 1-3mL之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉及1.0g/LBSA.將結合產物 置4℃，避光保存；

(3)鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化酶試劑的制備：將鏈霉親和 素偶聯的辣根過氧化酶用2％BSA，0.01MTris-HClpH7.4的緩沖液配 制為0.5ug～1ug/mL。

8.權利要求1-6任一項所述的試劑盒的應用，其特征在于，所述 應用的具體方法為：

1)將濃度分別為0U/mL、0.125U/mL、0.375U/mL、0.65U/mL、 1.0U/mL、1.25U/mL、1.6U/mL的C1-INH校準品各100μL依次加入 到微孔板中，然后將50μL患者血清加入微孔中，然后加入50μL生 物標記的C1-INH，室溫或37℃孵育15min～45min；

2)孵育結束后，洗板5次；

3)加入100μL鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化酶試劑，室溫或 37℃孵育15min～30min；

4)孵育結束后，洗板5次；

5)加入化學發光底物A液和底物B液各50μL，5min后讀數；

6)建立校準品曲線，將樣本檢測孔化學發光值代入校準品曲線， 計算出樣本中的C1-INH的含量；

或為：

1)在校準品檢測管中加入50μL磁珠微粒試劑，加入50μL校準 品；在樣本檢測管中加入50μL磁珠微粒試劑，然后加入25μL血清 樣本，再加入25μL生物素標記的C1-INH校準品，37℃孵育5～15min；

2)將孵育后的檢測管在磁場中分離，去除上清液，經洗液多次 清洗后，取出磁場，震蕩使磁珠微粒充分混懸；

3)向步驟2中的檢測管中加入100μL鏈霉親和素偶聯的辣根過 氧化酶試劑，37℃孵育5～15min；

4)將孵育后的檢測管在磁場中分離，去除上清液，經洗液多次 清洗后，取出磁場，震蕩使磁珠微粒充分混懸；

5)添加磁場，使步驟4)處理后的磁珠微粒在磁場中分離，去 除上清液，然后加入發光底物A和底物B，取出磁場，充分混勻厚繭 檢測5min內相對發光強度值。