[發明專利]促癌活性的定量檢測方法以及促癌劑的篩選方法

有效

• 申請號: 201410767572.2
• 申請日: 2014-12-15
• 公開（公告）號: CN104515758B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 鄧芙蓉;魏紅英;郭新彪;楊迪
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，特別是涉及一種促癌活性的定量檢測方法以及促癌劑的篩選方法。

背景技術

環境污染是當今社會倍受關注的問題。國內外的大量研究表明，在癌癥發生和發展過程中，70％以上的致癌和促癌因素與環境污染和人類行為密切相關。致癌性物質污染環境是增加癌癥發生的重要原因之一。導致人類癌癥的環境污染物可通過空氣、水和土壤對環境產生污染，致癌部位廣泛，包括肺、皮膚、膀胱、喉、卵巢、乳腺、鼻咽、腎及造血系統等。世界衛生組織國際癌癥研究中心的《世界癌癥報告2014》，列出了18類導致人類癌癥的環境污染物，如砷及其無機化合物、石棉、苯、1，3-丁二烯、六價鉻化合物等。這些致癌性環境污染物，有的是在工農業生產的職業過程中有所接觸，如石棉、苯、氡及其子體、；有的常見于日常生活，如家庭燃煤、室內空氣污染、室外懸浮顆粒、柴油機尾氣；還有個人生活行為產生的接觸，如吸煙和二手煙等。

隨著經濟和工業化的飛速發展，新的環境化學物質還將不斷涌現，人類的致癌風險仍將繼續增加。如何從種類繁多的化學物質中篩選出對人體可能致癌的物質，從而做到早期預防、保障人群健康不僅是非常關鍵的科學問題，也是一個亟需解決的社會問題。因此，發展高效、快速的化學物質致癌活性檢測技術和致癌劑篩選方法具有非常重要的科學價值和社會意義。

化學物質的致癌性包括遺傳毒性致癌性(致癌性)和非遺傳毒性致癌性(促癌性)。致癌劑引起細胞發生癌前病變，成為潛在的腫瘤細胞；促癌劑促進潛在的腫瘤細胞成為惡性轉化細胞，促進腫瘤的發生。促癌劑促進細胞轉化的機制復雜多樣，可以誘導局部組織炎癥、增生，促進細胞異常增殖，引起細胞增殖/凋亡平衡失調，抑制細胞通道的功能，刺激炎性細胞產生自由基等。

促癌活性/腫瘤促進作用(tumor promotion)是指能夠促進啟動細胞異常增殖并最終形成腫瘤的能力，表現為非遺傳毒性的致癌作用，在化學致癌作用的促長階段發揮作用。促癌作用是一個可逆的長期過程，它不同于啟動作用的迅速和不可逆性，在整個腫瘤的發生過程中具有重要作用。促癌劑具有器官特異性，必須在致癌劑作用后才能發揮促癌作用。

根據促癌劑的特點及其作用機制，人們設計了多種促癌活性的檢測方法，包括體內試驗方法、體外試驗方法及針對促癌劑作用機制的調控因子的檢測方法。體內實驗方法主要是采 用實驗動物模型，通過持續使受試動物暴露于待檢測的化學物質，經過一段時間之后，觀察動物中是否出現腫瘤以及腫瘤的部位、腫瘤大小、惡性程度等情況，由此判斷該化學物質是否具有促癌活性及其大小；體內實驗包括小鼠的二階段致癌試驗、大鼠肝癌促進模型、小鼠耳腫脹促癌模型等。雖然體內實驗能夠直觀地觀察到癌癥的發生，并可以用于探索促癌的分子機理，但是需要實驗動物為研究對象，研究周期相當長，并且對促癌劑具有靶器官特異性的選擇，不適用于促癌劑的快速、高效的篩查檢測以及不同器官組織促癌活性的檢測。

體外試驗方法包括c-Ha-rasV12G基因轉染細胞系促癌劑檢測模型、人前髓自血細胞貼壁試驗、培養細胞膽堿攝入試驗、培養細胞放射性無機磷攝入試驗。體外試驗方法大多以細胞研究對象，觀察在促癌劑的存在下，細胞發生的生物學改變。例如在c-Ha-rasV12G基因轉染細胞系促癌劑檢測模型中，采用電穿孔的方法，將突變的c-Ha-rasV12G基因轉入人胚肺成纖維細胞WI-38及人支氣管上皮細胞BEAS-2B中，將獲得的G418抗性(G418r)單克隆細胞株進行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后，進一步用促癌劑佛波醇酯處理，并選用克隆形成率、錨著獨立性生長、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改變對受試細胞進行了惡性程度檢測。克隆形成率增加、具有錨著獨立性生長特性、血清抗體含量增加及裸鼠成瘤實驗陽性表明佛波醇酯的促癌作用增強，c-Ha-rasV12G基因可使上皮細胞BEAS-2B獲得對PMA的促癌作用敏感性。體外試驗相比體內檢測簡單易行，但往往不能直接觀察到腫瘤的發生，有的體外試驗體系亦需培養較長的時間，且體外試驗的檢測原理多是促癌劑促進細胞增殖的效應，不能體現促癌劑的其他作用機制。