[發明專利]一種純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法

在審

• 申請號: 201410767485.7
• 申請日: 2014-12-12
• 公開（公告）號: CN105738628A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 張海濤;孫衛兵;張躍建
• 申請（專利權）人: 上海復星長征醫學科學有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王巍

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及一種多克隆抗體分離、純化方法，尤其涉及一種應用免疫親和柱純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法。

背景技術

人血漿成分中HDL(高密度脂蛋白)主要由載脂蛋白和脂質組成，是血漿中密度最高但組成極不均一的一類脂蛋白。HDL中的蛋白質主要由載脂蛋白apoA-I和apoA-II構成，另還含有少量的apoA-IV、CI、CII、CIII及E，其中apoA-I的含量最多而且又是HDL的主要功能蛋白質，因此可以用apoA-I的含量反映HDL的含量，間接診斷動脈粥樣硬化的發病與否。apoA-I還具有抗炎抗內毒素的功能，是研究脂類代謝的重點之一。

現有技術中最常用的檢測載脂蛋白A-I方法是免疫透射比濁法，其基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物，反應液出現濁度。當反應液中保持抗體過量時，形成的濁度會隨抗原量增加而增加，與一系列濃度的標準品對照，即可計算出待檢測物的含量。免疫透射比濁法檢測臨床樣本效果的決定因素之一是能夠獲得抗干擾能力強的人血漿載脂蛋白A-I抗體純品，即要盡量去除抗血清中除有效抗體之外的其他組分，以消除偽濁度的影響，因此分離純化、富集人血漿載脂蛋白A-I抗體的技術越來越顯示其重要性。從成份復雜的抗血清中富集、純化出目標抗體而又盡可能保持其活性和含量是一項艱巨而繁重的任務。而親和層析法是目前最有效的分離純化、富集目標抗體的技術之一，因而，擬進一步研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計一種通過免疫親和柱從抗血清中簡便、高效、特異性分離純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法。

本發明提供了一種純化羊抗人血清人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法。

本發明方法應用免疫親和柱高效純化羊抗人血清人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體。

本發明方法包括下列步驟：

1)瓊脂糖凝膠Sepharose6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝膠，活化過程如下：

a)取10mlSepharose6B放在布氏漏斗中抽干，用30ml去離子水分兩次洗滌后抽干，再加入少量0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃洗滌，立即轉入100ml燒杯中，冰浴下緩慢攪拌；

b)在通風櫥內稱取1g溴化氰，加去離子水10ml溶解，然后分批加入Sepharose6B中，邊加邊攪拌，同時測pH值，通過滴加2mol/LNaOH,使溶液pH維持在10.5，待溴化氰溶液滴加完畢，繼續攪拌30分鐘，pH保持不變，停止攪拌；

c)將活化的Sepharose6B加入小冰塊，迅速導入布氏漏斗中，以冰水抽洗成pH7，再迅速以150ml冷的0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃溶液抽洗得到活化的瓊脂糖凝膠Sepharose6B備用；

2)人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體免疫親和柱的制備：

人血漿載脂蛋白A-I與步驟1)活化的瓊脂糖凝膠Sepharose6B偶聯得到親和吸附填料，填入玻璃柱中制得人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體免疫親和柱，操作步驟如下：

d)偶聯

以純化制備獲得的人血漿載脂蛋白A-I純品作為配基，采用GEAKTA^TM快速蛋白層析儀purifier100系統HiTrap^TMDesalting脫鹽柱置換成親和偶聯緩沖液體系：pH8.3的內含有0.5MNaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶聯緩沖液：

將上述步驟1)c)活化好的Sepharose6B置于砂芯漏斗中用步驟2)d)偶聯緩沖液快速抽濾，然后迅速倒入人血漿載脂蛋白A-I蛋白溶液中進行偶聯，蛋白檢測儀監控偶聯過程；再用用10倍體積的所述偶聯緩沖液洗去未偶聯的人血漿載脂蛋白A-I蛋白溶液，得到Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合物；收集全部洗脫液，通過測定其蛋白質含量計算偶聯率；

e)封閉活性基團

將Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合物轉入5倍于偶聯復合物體積的pH8.0的內含有0.5MNaCl的0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液中，旋轉震蕩2h,以封閉瓊脂糖凝膠中多余的活性基團；

f)洗滌