[發明專利]一種純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法

在審

• 申請號: 201410767485.7
• 申請日: 2014-12-12
• 公開（公告）號: CN105738628A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 張海濤;孫衛兵;張躍建
• 申請（專利權）人: 上海復星長征醫學科學有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王巍

1.一種純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟：

1)瓊脂糖凝膠Sepharose6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝膠，活化過程如下：

a)取10mlSepharose6B放在布氏漏斗中抽干，用30ml去離子水分兩次洗滌后抽干，再加入少量0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃洗滌，立即轉入100ml燒杯中，冰浴下緩慢攪拌；

b)在通風櫥內稱取1g溴化氰，加去離子水10ml溶解，然后分批加入Sepharose6B中，邊加邊攪拌，同時測pH值，通過滴加2mol/LNaOH,使得pH維持在10.5，待溴化氰溶液滴加完畢，繼續攪拌30分鐘，pH保持不變，停止攪拌；

c)將活化的Sepharose6B加入小冰塊，迅速導入布氏漏斗中，以冰水抽濾，并調節pH7，再迅速以150ml冷的0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃溶液抽洗備用；

2)人血清前白蛋白免疫親和柱的制備：

人血清前白蛋白與瓊脂糖凝膠Sepharose6B偶聯得到親和吸附填料，填入玻璃柱中制得人前白蛋白免疫親和柱，操作步驟如下：

c)偶聯

以純化制備獲得的人血漿載脂蛋白A-I純品作為配基，采用GEAKTA^TM快速蛋白層析儀purifier100系統HiTrap^TMDesalting脫鹽柱置換成親和偶聯緩沖液體系：pH8.3的內含有0.5MNaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶聯緩沖液；

步驟1)活化好的Sepharose6B置于砂芯漏斗中用偶聯緩沖液快速抽洗，然后迅速倒入人血漿載脂蛋白A-I蛋白溶液中進行偶聯，蛋白檢測儀監控偶聯過程；用10倍體積以上的偶聯緩沖液去除未偶聯的人血漿載脂蛋白A-I溶液，得到Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合物；收集全部洗脫液，通過測定其蛋白質含量計算偶聯率；

d)封閉活性基團

將Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合物轉入5倍體積pH8.0的內含有0.5MNaCl的0.1mol/LTris-HCl緩沖液中，旋轉震蕩約2h,以封閉瓊脂糖凝膠中多余的活性基團；

e)洗滌

步驟1)得到的Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合物依次用10倍偶聯復合物體積的pH4.0的內含有0.5MNaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液和5倍體積的pH8.0的內含有0.5MNaCl的0.1mol/LTris-HCl緩沖液中洗滌，此洗滌過程重復三次；然后用10倍偶聯復合物體積的PBS洗滌2次；

f)裝柱

將上述得到的Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合物填充5ml或10ml固相萃取空柱管中，在負壓下用PBS將凝膠壓緊，制成Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白免疫親和柱；

g)保存

步驟(f)制備好的Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白偶聯復合，使用含有萬分之二疊氮鈉的PBS緩沖液浸泡，2～8℃密封保存；

3)純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體：

取免疫后羊抗人血清人血漿載脂蛋白A-I抗血清200ml，依次用0.8um、0.45um微孔濾膜過濾，濾液過制備的Sepharose6B-人血漿載脂蛋白A-I蛋白親和柱，柱子用含50ml的PBS預處理：分別用50ml含0.5MNaCl的PBS淋洗雜質組分，紫外檢測器檢測吸光度平衡后，用pH4.0的內含有0.5MNaCl的0.1mol/LTris-檸檬酸緩沖液洗脫，洗脫液經HiTrap^TMDesalting脫鹽柱置換成PBS緩沖液后，自動生化儀AU400上機，標準品定標測試，觀察定標曲線的線性。

2.根據權利要求1所述一種純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法,其特征在于，所述步驟2)d)偶聯過程中使用單蛋白配基偶聯緩沖液的置換采用的脫鹽柱體系選自HiTrapTMDesalting或Hiprep26/10Desalting。

3.根據權利要求2所述一種純化羊抗人血漿載脂蛋白A-I多克隆抗體的方法,其特征在于，所述步驟2)d)偶聯過程中使用單蛋白配基偶聯緩沖液的置換采用的脫鹽柱體系為HiTrap^TMDesalting。