[發(fā)明專利]一種胃蛋白酶酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410766878.6
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN104535637A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段蕊;張俊杰;王永久;蔡學(xué)東;張建東
• 申請（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院;連云港金水灣食品有限公司
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 南京理工大學(xué)專利中心 32203
• 代理人: 朱顯國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，屬于生物檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

明膠是大分子膠原蛋白受熱后局部分解后的產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)中都具有α鏈組成的三股螺旋構(gòu)象(即膠原域)。生物體中存在的膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)，它主要存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、腱肌、韌帶和血管中，是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官保護機體的功能。而明膠則是膠原蛋白受熱發(fā)生局部分解或解螺旋后的產(chǎn)物。目前膠原蛋白或明膠主要來源于豬皮、牛骨或水產(chǎn)動物的魚皮、魚骨等組織，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、美容等行業(yè)。不同來源的膠原蛋白或明膠具有不同的應(yīng)用區(qū)域。由于宗教的原因，水產(chǎn)動物膠原蛋白具有更廣泛的應(yīng)用區(qū)域。但由于膠原蛋白及明膠產(chǎn)品都具有相似的三股螺旋結(jié)構(gòu)，常用的蛋白質(zhì)測定方法如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外分光光度法，沒有辦法將區(qū)別膠原蛋白的來源，即不同物種的膠原蛋白目前區(qū)分比較困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)解決方案是：

一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，其步驟如下：

(1)原料溶解：取大分子膠原蛋白或明膠5-50mg，溶于1-50毫升0.1-0.5mol的乙酸中，配成濃度為0.1-10mg/ml的蛋白質(zhì)溶液；

(2)加熱變性：將蛋白質(zhì)溶液在30-100℃水浴中加熱，加熱時間為10-100分鐘；

(3)加入胃蛋白酶：再在蛋白質(zhì)溶液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的用量為大分子膠原蛋白或明膠用量的0.1wt％-10wt％；

(4)酶解反應(yīng)：將加入胃蛋白酶的蛋白質(zhì)溶液于水浴中反應(yīng)10-100分鐘，反應(yīng)溫度為10-60℃；

(5)酶解終止：取反應(yīng)后的溶液1毫升，加入胃蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基磺酰氟)5-50微升，終止酶解過程；

(6)制備電泳樣品：在終止酶解過程的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為0.1-10mol/L的Tris溶液(三羥甲基氨基甲烷)10-100微升，充分混勻后于沸水浴中加熱1-10分鐘；

(7)電泳樣品儲存：將沸水浴加熱后的樣品立即冷卻至0℃。

(8)電泳：進行SDS-PAGE電泳試驗。

本發(fā)明的原理是：盡管不同來源的膠原蛋白或明膠均具有相似的三螺旋結(jié)構(gòu)，但組成三螺旋結(jié)構(gòu)的α鏈亞基的氨基酸序列不相同，經(jīng)過胃蛋白酶的酶解會會產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)片段(肽段)。采用SDS-PAGE的方法，將不同的肽段顯示出來，即得到酶解片段的圖譜。不同來源的膠原蛋白經(jīng)過酶解后得到不同的肽段圖譜，根據(jù)肽段圖譜即可以區(qū)別膠原蛋白或明膠的來源。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：可以對大分子膠原蛋白或明膠的來源進行鑒別，方法簡單、結(jié)果精確。

附圖說明

圖1為經(jīng)本發(fā)明的胃蛋白酶酶解后的肽段圖譜。

1：高分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記物；2：鰱魚皮提取的膠原蛋白；3：鰱魚皮提取膠原蛋白的酶解肽段圖譜；4：鰱魚鱗提取膠原蛋白的酶解肽段圖譜；5：鯉魚皮提取的膠原蛋白的酶解肽段圖譜。

具體實施方式

實例1：

(1)原料溶解：取來源于鰱魚皮的大分子膠原蛋白6mg，溶于24毫升0.2mol的乙酸中，配成濃度為0.25mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。

(2)加熱變性：將配成的大分子膠原蛋白或明膠溶液在50℃水浴中加熱，加熱時間為60分鐘。

(3)加入蛋白酶：在溶液中加入胃蛋白酶(1:10000)，酶制劑購自于sigma公司，其用量為蛋白樣品用量的2％。

(4)酶解反應(yīng)：將加入胃蛋白酶的大分子膠原蛋白或明膠溶液在水浴鍋中反應(yīng)50分鐘，反應(yīng)溫度為30℃。

(5)酶解終止：取反應(yīng)后的溶液1毫升，加入胃蛋白酶抑制劑PMSF30微升，終止酶解過程。

(6)制備電泳樣品：在終止反應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為2mol/L的Tris溶液50微升，充分混勻后于沸水浴加熱6分鐘。

(7)電泳樣品儲存：將沸水浴加熱后的樣品立即冷卻至0℃，冷卻可以在冰水進行，或放入冷凍箱。