[發(fā)明專利]一種基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410766211.6
• 申請(qǐng)日: 2014-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN105779569B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳曉明;王超;朱捷;宋收;羅學(xué)剛;王丹;唐運(yùn)來(lái);張建國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12R1/07
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 曾曉波

本發(fā)明公開了一種基于PFGE分析微生物菌株之間的差異基因的方法，采用限制性內(nèi)切酶對(duì)樣品基因組進(jìn)行酶切，酶切后的DNA利用PFGE技術(shù)進(jìn)行分離，對(duì)差異條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，得到的序列即為物種間的差異基因。本發(fā)明采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）來(lái)尋找不同菌株之間的差異基因，PFGE技術(shù)在尋找差異基因方面表現(xiàn)出更高的優(yōu)越性，此方法操作簡(jiǎn)單，可行性高，價(jià)格低廉。采用本發(fā)明所述方法，成功發(fā)現(xiàn)了屬于同一種屬不同亞種的菌株在基因水平上的不同，確立了PFGE技術(shù)在尋找同種菌株基因片段差異研究的可行性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因差異分析領(lǐng)域，具體涉及基于PFGE分析相似微生物菌株之間的差異基因的方法。

技術(shù)背景

目前尋找物種間差異基因的方法很多，例如基因芯片技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫印跡雜交技術(shù)等。這些成熟技術(shù)具有準(zhǔn)確性與高通量等優(yōu)點(diǎn)，但它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中有很大的局限性。

基因芯片技術(shù)利用DNA分子可以變性、雜交的特性，通過(guò)DNA芯片上固定的探針或樣品DNA與游離的樣品DNA或探針雜交來(lái)推斷未知靶分子，雜交發(fā)生與否可采用熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)。基因芯片技術(shù)具有高通量、并行性及自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，它的缺點(diǎn)在于不能對(duì)多細(xì)胞類型組織中的待檢測(cè)基因進(jìn)行精確定位. 另外很多蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其功能不是依賴其是否表達(dá)或表達(dá)量高低，而是依賴蛋白質(zhì)磷酸化-去磷酸化等方式。在這種情況下，用核酸類生物芯片就沒有什么意義了。

原位雜交技術(shù)是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過(guò)堿基之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。該技術(shù)可以對(duì)mRNA進(jìn)行定位、定性、定量，表達(dá)部位很明確，但是定量不精確。

免疫印跡雜交技術(shù)是將蛋白樣本通過(guò)聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，在轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后通過(guò)一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法，是進(jìn)行蛋白分析最流行和成熟的技術(shù)之一。但是該法技術(shù)復(fù)雜，難于操作。

發(fā)明內(nèi)容

脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）利用有規(guī)律地、變化的電場(chǎng)，使得大分子DNA在泳道中不停的改變方向，使得大分子DNA結(jié)構(gòu)趨于線性，易于在凝膠中前行，從而分離開來(lái)。在生物技術(shù)領(lǐng)域具有較廣泛的應(yīng)用。然而，利用PFGE技術(shù)對(duì)同種不同亞種菌之間的差異基因進(jìn)行分析接方法目前還未見報(bào)道。本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種基于PFGE分析相似微生物菌株之間的差異基因的方法。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，采用限制性內(nèi)切酶對(duì)樣品基因組進(jìn)行酶切，酶切后的DNA利用PFGE技術(shù)進(jìn)行分離，對(duì)差異條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，得到的序列即為物種間的差異基因。

一種基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，包括以下步驟：

1）將被分析的菌株分別制成包裹DNA的PFGE電泳凝膠塊，然后采用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行酶切處理；

2）利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)酶切后的基因進(jìn)行電泳分離，得到不同的DNA條帶；

3) 觀察不同菌株對(duì)應(yīng)的條帶，找出差異條帶，切膠回收該差異片段進(jìn)行克隆測(cè)序，得到差異條帶對(duì)應(yīng)的基因序列，即得到菌株之間的差異基因序列。