[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410766211.6
• 申請(qǐng)日: 2014-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105779569B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳曉明;王超;朱捷;宋收;羅學(xué)剛;王丹;唐運(yùn)來(lái);張建國(guó)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西南科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12R1/07
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 曾曉波

1.一種基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將被分析的菌株分別制成PFGE電泳凝膠塊，然后采用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切處理；

2)利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)酶切后的基因進(jìn)行電泳分離，得到不同的DNA條帶；

3)觀察不同菌株對(duì)應(yīng)的條帶，找出差異條帶，切膠回收該差異片段進(jìn)行克隆測(cè)序，得到差異條帶對(duì)應(yīng)的基因序列，即得到菌株之間的差異基因序列;

所述酶切處理中所述的內(nèi)切酶為BamHI、EcoRI、PstI、SmaI、HindIII中的至少一種；

所述酶切處理中分別采用了BamHI、EcoRI、PstI、SmaI核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行單酶切，或分別采用EcoRI-HindIII(EH)、EcoRI-BamHI(EB)、BamHI-HindIII(BH)三種組合對(duì)DNA進(jìn)行雙酶切；所述酶切的目的在于將數(shù)量龐大的基因分成多段，盡可能的將序列相同的片段排除，從而將重點(diǎn)集中到含有差異基因的位置；

還包括酶切位點(diǎn)驗(yàn)證步驟，具體為：從NCBI上查閱所述差異基因的序列，對(duì)差異序列上的酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，驗(yàn)證差異序列是否存在與步驟1)中使用的內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)；

還包括差異基因驗(yàn)證步驟，具體為：以步驟3)的得到的差異基因序列的全長(zhǎng)或其片段為模板設(shè)計(jì)引物，然后使用該引物分別以被分析的菌株為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)是否能獲得所述差異基因序列的全長(zhǎng)或其片段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，其特征在于，還包括差異基因驗(yàn)證步驟，具體為：從基因庫(kù)中篩選出一種已知基因作為模板設(shè)計(jì)引物，然后使用該引物分別以被分析的菌株為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)是否能獲得該已知基因，所述已知基因中含有與步驟1)中使用的內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)，且該已知基因中該酶切位點(diǎn)一側(cè)的基因序列與所述差異基因某一側(cè)端部的基因片段序列相同或與所述差異基因的全長(zhǎng)序列相同。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，其特征在于，篩選出的已知基因與所述差異基因的一致性在85％以上。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，其特征在于，還包括差異基因功能驗(yàn)證步驟，具體為：將所述差異基因序列的全長(zhǎng)或其片段或者將含有差異基因序列的全長(zhǎng)或其片段且含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的已知基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入到本來(lái)不含該差異基因的菌株中，獲得轉(zhuǎn)基因菌株，然后通過(guò)比較非菌株與轉(zhuǎn)基因菌株來(lái)驗(yàn)證所述差異基因的功能。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，其特征在于，所述電泳分離步驟中，電泳緩沖液為0.5×TBE、電泳溫度14℃、脈沖角度120°、電壓6V/cm，脈沖轉(zhuǎn)換時(shí)間為2.16s-63.8s，電泳時(shí)間為9h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PFGE分析菌株之間的差異基因的方法，其特征在于，所述PFGE電泳凝膠塊的制備具體包括：

(1)菌種活化：將菌中接種于培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)；

(2)菌體收集：離心收集步驟一種培養(yǎng)得到的菌體；

(3)膠塊制備：將菌體與瓊脂糖混合制成凝膠；

(4)去細(xì)胞壁：向凝膠中溶菌酶，37℃孵育去細(xì)胞壁；

(5)細(xì)胞裂解：將溶菌酶吸出后，向凝膠中加入細(xì)胞裂解液，50℃孵育；

(6)去蛋白：將裂解液吸出后，向凝膠中加入PMSF，50℃處理2次，然后用TE緩沖液沖洗膠塊。