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[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)罕見(jiàn)序列變體的組合物和方法有效

專(zhuān)利信息
申請(qǐng)?zhí)枺?/td> 201410765164.3 申請(qǐng)日: 2014-12-11
公開(kāi)(公告)號(hào): CN104946737B 公開(kāi)(公告)日: 2019-02-22
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 林盛榕;孫朝輝;趙奇志;鄧凌鋒 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人: 安可濟(jì)控股有限公司
主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6869 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6869;C12N15/10;C12M1/34
代理公司: 北京安信方達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262 代理人: 鄭霞
地址: 開(kāi)曼群島*** 國(guó)省代碼: 開(kāi)曼群島;KY
權(quán)利要求書(shū): 查看更多 說(shuō)明書(shū): 查看更多
摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 用于 檢測(cè) 罕見(jiàn) 序列 變體 組合 方法
【說(shuō)明書(shū)】:

在一些方面,本發(fā)明提供了用于鑒定核酸樣品中的序列變體的方法。在一些實(shí)施方案中,方法包括鑒定測(cè)序讀取與參考序列之間的序列差異,以及將存在于至少兩個(gè)不同的環(huán)狀多核苷酸,如兩個(gè)具有不同接點(diǎn)的環(huán)狀多核苷酸中的序列差異判定為序列變體。在一些方面,本發(fā)明提供了可用于所述方法中的組合物和系統(tǒng)。

交叉引用

本申請(qǐng)要求在2013年12月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/914,907、在2014年5月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/987,414和在2014年6月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/010,975的權(quán)益;上述所有美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文。

背景技術(shù)

鑒定復(fù)雜群體內(nèi)的序列變異是一個(gè)活躍發(fā)展的領(lǐng)域,特別是隨著大規(guī)模平行核酸測(cè)序的出現(xiàn)。然而,由于常用技術(shù)的固有誤差頻率比群體內(nèi)許多實(shí)際序列變異的頻率更大,大規(guī)模平行測(cè)序具有顯著的局限性。例如,0.1-1%的誤差率已在標(biāo)準(zhǔn)的高通量測(cè)序中被報(bào)道。當(dāng)變體頻率低,如等于或低于誤差率時(shí),對(duì)罕見(jiàn)序列變體的檢測(cè)具有高的假陽(yáng)性率。

檢測(cè)罕見(jiàn)序列變體的原因有很多。例如,檢測(cè)罕見(jiàn)特征性序列可用于鑒定和區(qū)分有害環(huán)境污染物如細(xì)菌分類(lèi)群的存在。表征細(xì)菌分類(lèi)群的常見(jiàn)方式是鑒定高度保守序列如rRNA序列的差異。然而,針對(duì)此的典型的基于測(cè)序的方法面臨與給定樣品中如此多數(shù)量的不同基因組和成員之間的同源性程度相關(guān)的挑戰(zhàn),從而為本已繁瑣的程序呈現(xiàn)出復(fù)雜的問(wèn)題。改進(jìn)的程序?qū)⒕哂屑訌?qiáng)在多種設(shè)置下的污染檢測(cè)的潛力。例如,用于組裝衛(wèi)星和其他空間飛行器的部件的潔凈室可使用本系統(tǒng)和方法進(jìn)行勘測(cè),以了解存在何種微生物群落,并且開(kāi)發(fā)更好的去污染和清潔技術(shù),從而防止將地球微生物引入其他星球或其樣品,或開(kāi)發(fā)用來(lái)將由推定的地球外微生物產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與由污染性地球微生物產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)分的方法。食品監(jiān)測(cè)應(yīng)用包括對(duì)食品加工廠生產(chǎn)線的定期檢測(cè),調(diào)查屠宰場(chǎng),檢查餐廳、醫(yī)院、學(xué)校、監(jiān)獄和其他機(jī)構(gòu)的廚房和食品儲(chǔ)存區(qū)的食源性病原體。也可以類(lèi)似地監(jiān)測(cè)水源儲(chǔ)備和加工廠。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述,對(duì)改進(jìn)的檢測(cè)罕見(jiàn)序列變體的方法存在需求。本發(fā)明的組合物和方法滿足了該需求,并且還提供了另外的益處。特別是,本發(fā)明的各個(gè)方面提供了對(duì)罕見(jiàn)或低頻核酸序列變體(有時(shí)稱(chēng)為突變)的高度靈敏的檢測(cè)。這包括對(duì)在正常序列背景中可能含有少量變異序列的樣品中的低頻核酸變異(包括取代、插入和缺失)的鑒定和闡明,以及對(duì)在測(cè)序錯(cuò)誤背景下的低頻變異的鑒定。

在一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種鑒定序列變體,例如核酸樣品中的序列變體的方法。在一些實(shí)施方案中,多個(gè)多核苷酸中的每個(gè)多核苷酸具有5’末端和3’末端,并且該方法包括:(a)將所述多個(gè)多核苷酸中的單獨(dú)多核苷酸進(jìn)行環(huán)化以形成多個(gè)環(huán)狀多核苷酸,其中每個(gè)環(huán)狀多核苷酸在5’末端與3’末端之間具有接點(diǎn)(junction);(b)擴(kuò)增(a)的環(huán)狀多核苷酸;(c)對(duì)擴(kuò)增的多核苷酸進(jìn)行測(cè)序以生成多個(gè)測(cè)序讀取;(d)鑒定測(cè)序讀取與參考序列之間的序列差異;和(e)將存在于至少兩個(gè)具有不同接點(diǎn)的環(huán)狀多核苷酸中的序列差異判定(calling)為序列變體。在一些實(shí)施方案中,該方法包括鑒定測(cè)序讀取與參考序列之間的序列差異,以及將存在于至少兩個(gè)具有不同接點(diǎn)的環(huán)狀多核苷酸中的序列差異判定為序列變體,其中:(a)該測(cè)序讀取對(duì)應(yīng)于該至少兩個(gè)環(huán)狀多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物;且(b)該至少兩個(gè)環(huán)狀多核苷酸中的每一個(gè)包含通過(guò)連接相應(yīng)多核苷酸的5’末端和3’末端而形成的不同的接點(diǎn)。

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