[發明專利]一種土壤抗生素污染的診斷方法

有效

• 申請號: 201410764095.4
• 申請日: 2014-12-12
• 公開（公告）號: CN104531835A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 楊肖娥;劉娣;盧玲麗;馮英;李廷強
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/52
• 分類號: C12Q1/52;C12Q1/42;C12Q1/32
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于污染環境修復技術領域，尤其涉及一種土壤抗生素污染的診斷方法。

背景技術

在二十世紀，抗生素可以說是醫藥界最偉大的發明之一。抗生素被廣泛用于人類、畜禽業及水產養殖中各種疾病的防治。但絕大部分抗生素不能完全被機體吸收，以原形或者代謝物形式經由病人和畜禽的糞、尿排入環境，經不同途徑對畜類食品、禽類食品、水產品、水體和土壤造成了污染，進而通過食物鏈危害人類健康。

中國是世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一，抗生素一方面可以導致器官的損傷，另一方面可以引起細菌的耐藥性增強，形成超級細菌，使人類無藥可醫，我國每年有8萬人死于濫用抗生素。在眾多的抗生素中，四環素類和青霉素類抗生素是在世界范圍內應用最為廣泛的抗生素。近年來，四環素和青霉素類抗生素的使用呈上升勢頭，導致其藥物殘留問題日趨嚴重，排放到環境中的藥物及其潛在的影響也引起了越來越多的科學家的關注。

土壤是抗生素等污染物質的最終歸宿地，大量抗生素的使用必將造成嚴重的抗生素類土壤污染問題。隨著抗生素長期暴露于土壤環境中，抗生素對土壤環境中的動植物產生毒性影響，土壤中的抗生素極易向植物體內富集，并在食物鏈中經生物富集、濃縮和傳遞，對人類健康造成危害。綜上，控制和檢測抗生素的殘留，研究抗生素污染的生態毒性效應是非常必要的。

歐盟規定的環境中藥物安全的限量值為100μg·L^-1。目前，抗生素殘留的檢測方法主要包括高效液相色譜法、色譜/質譜聯用測定法等，大多數的檢測方法具有一定可靠性和較好的靈敏度，但是這些方法也存在一定的局限性，如費時，操作繁瑣，需要昂貴的儀器，另外還會受到儀器檢測限的限制；還有一些快速的檢測方法，如微生物抑制法、酶聯免疫法等，這些方法對實驗條件要求比較高，試劑容易受到污染；而且這些傳統的檢測方法只能定量計算抗生素的濃度，而無法評估抗生素的生物毒性。

發明內容

本發明提供了一種土壤抗生素污染的診斷方法，具有簡單、快速、成本低廉的優點。

一種土壤抗生素污染的診斷方法，包括以下步驟：

(1)將肝細胞接種到一組抗生素濃度呈梯度分布的培養基中培養，培養一段時間后檢測培養基中肝細胞分泌的酶的活性；

(2)建立培養基中抗生素濃度與所述酶的活性之間的關系曲線；

(3)將肝細胞接種到含待測土壤浸提液的培養基中培養，培養一段時間后檢測相應酶的活性，根據關系曲線計算得到待測土壤中抗生素的濃度；

所述酶為乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶或丙氨酸氨基轉移酶。

本發明對肝細胞培養基中抗生素濃度與所述酶的活性之間建立關系曲線，再根據關系曲線計算得到待測土壤中抗生素的濃度，方法簡單快速；所述乳酸脫氫酶的活性指示肝細胞膜的通透性，堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉移酶的活性可以指示肝細胞的功能，本發明通過檢測酶的活性，還可以評估抗生素的生物毒性。

本發明中所述肝細胞為人體肝細胞HL-7702，采用人體肝細胞HL-7702的酶的活性作為檢測抗生素的指標，可以評估抗生素對人體的毒性。

本發明中所述抗生素為四環素或青霉素，四環素和青霉素的應用范圍最為廣泛，更具代表性。

本發明步驟(2)中采用線性回歸或一元二次方程擬合建立關系曲線，所述關系曲線為：

y₁＝0.1258X₁+146.67，R²＝0.9591，0≤y₁≤2500；

y₁＝0.0002x₂+0.9604，R²＝0.8757，0≤y₁≤2500；

y₁＝0.0091x₃+2.685，R²＝0.9677，0≤y₁≤500；

y₂＝0.1009x₁+69.717，R²＝0.8727，0≤y₂≤2500；

y₂＝0.0003x₂+0.9681，R²＝0.9135，0≤y₂≤2500；

y₂＝0.0025x₃+3.1936，R²＝0.9552，0≤y₂≤2500；