[發(fā)明專利]一種三葉青基因組DNA提取純化的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410763362.6
• 申請(qǐng)日: 2014-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN104450681A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華金渭;朱波;吉慶勇;程文亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于DNA提取純化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種三葉青基因組DNA提取純化的方法。

背景技術(shù)

三葉青又名金線吊葫蘆、絲線吊金鐘、三葉扁藤、石老鼠等，系葡萄科崖爬藤屬植物三葉青Tetrastigma?hemsleyanum?Diels?et?Gilg.，以塊根或全草入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效，主治小兒高熱驚厥、百日咳、疔瘡癰疽、淋巴結(jié)結(jié)核、痢疾、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎及病毒性腦膜炎，外用治毒蛇咬傷，扁桃體炎，蜂窩織炎，跌打損傷，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、四川等地區(qū)。

三葉青的提取制劑對(duì)食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、膽囊癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病、淋巴癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多種原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌等均具有很好的治療作用。對(duì)腫瘤化療帶來的種種不良反應(yīng)，如食欲低下、嘔吐、惡心、頭發(fā)脫落以及白細(xì)胞減少等都有明顯的改善作用，對(duì)晚期患者有緩解疼痛作用，還能有效地提高人體的免疫功能。三十年前，中國(guó)的三葉青資源極為豐富，野生三葉青除作藥用外，還常做菜肴食用。隨著社會(huì)的發(fā)展、自然環(huán)境的惡化、以及人們無節(jié)制地亂采濫挖，致使野生三葉青野生資源枯竭，瀕臨滅絕。三葉青為多年生植物，次生代謝產(chǎn)物多，DNA提取純化難，如何有效地利用三葉青資源，提取純化其DNA，成為大家關(guān)注的一個(gè)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種三葉青基因組DNA提取純化的方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種三葉青基因組DNA提取純化的方法，包括如下步驟：將三葉青葉片純化后加入細(xì)胞核裂解緩沖液，于65℃水浴40min后采用萃取液進(jìn)行萃取，取上清液，加入等體積的異丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70％乙醇、75％乙醇洗滌DNA沉淀物，干燥，加入TE緩沖液(Tris-EDTA緩沖液)，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37℃水浴消化30min，得到三葉青基因組DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的三葉青葉片優(yōu)選為研磨成顆粒狀的三葉青葉片；

所述的三葉青葉片優(yōu)選采用如下方法研磨成顆粒狀的三葉青葉片：剪取三葉青當(dāng)年生新鮮葉片，去離子水清洗三遍，晾干后放入研缽中，加入pvp(聚乙烯吡咯烷酮)，液氮中研磨至顆粒狀的三葉青葉片。

所述的純化優(yōu)選采用如下方法進(jìn)行：將三葉青葉片置于盛有細(xì)胞核純化液的離心管中進(jìn)行純化，離心，取沉淀，得到純化后的三葉青葉片；

所述的細(xì)胞核純化液由如下成分組成：100mM?Tris-HCl?pH?8.0、20mM?EDTA、0.25M?NaCl以及2wt％β-巰基乙醇。

所述的細(xì)胞核裂解緩沖液由如下成分組成：2wt％CTAB、2wt％PVP、100mM?Tris-HCl?pH8.0、25mM?EDTA及2.0M?NaCl。

所述的萃取液為體積比為24:1的氯仿-異戊醇。

所述的萃取的次數(shù)優(yōu)選為兩次。

所述的沉淀采用如下方法進(jìn)行：-20℃冰箱放置30min。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明通過將三葉青葉片純化后加入細(xì)胞核裂解緩沖液進(jìn)行裂解，然后通過TE緩沖液溶解和RNA消化酶消化，得到三葉青基因組DNA。該三葉青基因組DNA的質(zhì)量好，其葉綠素DNA和線粒體DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，純化后DNA的OD260/OD280達(dá)到了1.954，濃度為866ng/μL，可以用于構(gòu)建遺傳圖譜和基因組測(cè)序等方面研究。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的三葉青基因組DNA提取純化的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

如圖1所示，本發(fā)明提供了一種三葉青基因組DNA提取純化的方法，包括如下步驟：