[發明專利]一種復合菌劑及其制產纖維素酶的方法

在審

• 申請號: 201410759440.5
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN104403980A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 王小芬;崔宗均;劉晶晶;王小娟;袁旭峰;朱萬斌
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/14;C12N9/42;C12R1/145;C12R1/01;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及一種復合菌劑及其制產纖維素酶的方法，屬于農業發酵技術領域。

背景技術

隨著畜牧業的迅猛發展，如何提高粗飼料的營養價值并增加其瘤胃消化率已成為全球研究的熱點。近年來，青貯或日糧中添加纖維素酶制劑引起了人們的廣泛關注，然而受各種因素的影響，如酶的生產成本、種類和添加量、酶的反應條件等，其推廣使用尚存在一些限制。

對于纖維素酶的生產菌株，以往的研究多集中在純化菌，但在以秸稈等天然木質纖維素材料為底物時，純化菌株定植緩慢，產酶效率低。近年來研究發現在發酵過程中將微生物共培養能夠增加纖維素酶的量，篩選構建復合系對木質纖維素進行降解和生產纖維素酶成為研究熱點。

另外，現有的酶制劑生產工藝包括液態發酵(Submerged?Fermentation，SmF)和固態發酵(Solid-state?Fermentation，SSF)。但液態發酵存在木質纖維素材料的降解難度大，轉化成本高的缺陷，因此固態發酵產酶成為具有應用前景的技術手段。

然而現有生產纖維素酶的方法存在效率低、成本高的缺陷，遠沒有滿足實際生產需求，因此需要尋找一種高效的產酶菌、產酶工藝和廉價的發酵底物。

發明內容

本發明第一目的是提供一種復合菌劑，以秸稈為底物，對其進行固態發酵生產木質纖維素酶，所得纖維素酶的活力高，提高了產酶效率，降低了酶的生產成本，同時也增加了秸稈的利用率，為秸稈等農業廢棄物的利用及非常規飼料的開發和應用提供了新途徑。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種復合菌劑，是由緩纖維梭菌、解木聚糖擬桿菌、噬纖維菌、灰蓋鬼傘菌分別接種于培養基，發酵培養后將發酵液混合得到的發酵混合液；其中所述發酵混合液中緩纖維梭菌、解木聚糖擬桿菌、噬纖維菌、灰蓋鬼傘菌的菌落形成單位數目比為20-25：15-20：15-20：40-50，菌落形成單位數目為0.8×10⁶-1.2×10⁶CFU。

其中，所述緩纖維梭菌(Clostridium?lentocellum)，其保藏編號為ATCC?49066。

所述解木聚糖擬桿菌(Bacteroides?xylanisolvens)，其保藏編號為DSM?18836。

所述噬細胞菌(Cytophaga?sp.)，其保藏編號為ATCC13125。

所述灰蓋鬼傘菌(Coprinus?cinereus)，其保藏編號為CGMCC?NO.4051。

所述培養基為Mandels培養基，其配方如下：

同時在培養基中添加小麥秸稈作為唯一的碳源，長度為2-3cm，添加量為前述培養基總質量的1％。

所述發酵培養條件為：33-37℃靜止培養7d。

上述復合菌劑還可制成本領域常用固體劑型，所述固體復合菌劑是由上述發酵混合液與載體按0.8×10⁶-1.2×10⁶CFU：(1－10)g比例配制而得；優選地，所得發酵混合液與載體按1×10⁶CFU：5g比例配制。

所述載體為麥飯石和/或秸稈粉。

本發明的另一個目的是提供一種高效低廉制產纖維素酶的方法，是以秸稈為底物，將復合菌劑接種到培養基中進行固態發酵培養，得到纖維素復合酶。所述纖維素復合酶包括纖維素酶、半纖維素酶和β-葡萄糖苷酶。

所述方法具體步驟如下：

1)將秸稈粉碎與培養基混合，115-120℃滅菌15-30min，冷卻；

2)將上述復合菌劑接種到步驟1)所得體系中，每天攪拌一次，30-35℃培養7-10天，將發酵產物真空干燥，得到固態纖維素復合酶。

其中，所述秸稈為水稻、小麥、玉米或其它木質纖維素材料，長度＜1mm。

所述培養基配方為(g/l)：

所述秸稈與培養基混合比例為5-10:15-20(g/ml)，優選10：15(g/ml)。

所述復合菌劑添加量為每千克培養基中菌落形成單位數目為0.16×10⁶-0.24×10⁶CFU。