[發明專利]一種GH11耐熱木聚糖酶基因的異源表達

無效

• 申請號: 201410758794.8
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104388450A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;何瑤;朱利娟;李劍芳;王春娟;殷欣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12R1/01
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技術領域

本發明涉及一種來源于嗜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca)的糖苷水解酶11家族耐熱木聚糖酶(SyXyl11)基因的異源表達、活性測定和酶學性質分析的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

纖維素、半纖維素和木質素是植物細胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纖維素的重要組成部分，它是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是降解木聚糖的一組酶的總稱，由于木聚糖的來源不同，其結構的復雜性也不同，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成，如內切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、葡糖糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等。其中最重要的是β-1,4-內切木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase,EC?3.2.1.8)，它能從木聚糖主鏈的內部隨機切割木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是半纖維素類資源轉化和利用不可缺少的生物催化劑。根據催化結構域氨基酸的同源性和疏水簇分析法可將木聚糖酶劃分為糖苷水解酶10家族和11家族。木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織等工業領域都有著重要的應用價值，但由于紙漿漂白、飼料制粒等工藝均需要較高溫度，因此耐熱木聚糖酶的研究和開發受到了很多研究者的關注。目前已發現了許多能產11家族耐熱木聚糖酶的微生物，其中許多耐熱木聚糖酶基因已被克隆并表達在合適的宿主中。根據密碼子的偏好性，宿主細胞能夠以不同的速度合成蛋白質。編碼蛋白質的基因中有些密碼子對應的tRNA含量少(即屬于稀有密碼子)，所以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質的合成速度。因此按照密碼子的偏好性，對外源蛋白編碼基因進行密碼子優化可以有效提高外源蛋白的表達量。目前大腸桿菌表達系統以其成本低廉、生產率高、操作簡單等優點備受青睞。

發明內容

本發明的目的是提供一種來源于嗜熱裂孢菌的GH11耐熱木聚糖酶(SyXyl11)基因的異源表達、活性測定和酶學性質分析方法，為該酶的異源高效表達和產業化生產奠定理論基礎。

本發明的技術方案：將源自嗜熱裂孢菌的GH11耐熱木聚糖酶的基因xyl11催化域根據大腸桿菌密碼子偏好性進行序列優化，優化后基因命名為Syxyl11，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1，編碼的蛋白質為SyXyl11，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2；將該優化基因在大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21(DE3)中表達，并對表達產物進行活性測定及酶學性質分析。

所述的xyl11是一種來源于嗜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca?NTU22)的耐熱木聚糖酶基因(GenBank登錄號為AY795559)，它的熱穩定性非常好，具有適合于工業應用的理想特性。

所述的SyXyl11的異源表達、活性測定和酶學性質分析方法：

(1)重組質粒pUCm-T-Syxyl11的構建：根據大腸桿菌密碼子的偏好性，對來源于嗜熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶基因xyl11催化域(570bp)進行密碼子優化，并在其催化域基因兩端分別加入EcoR?Ⅰ、Not?Ⅰ位點，該基因命名為Syxyl11；人工合成該基因后克隆至pUCm-T質粒，轉化E.coli?JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質粒pUCm-T-Syxyl11。

(2)重組表達質粒的構建：將上述得到的重組質粒pUCm-T-Syxyl11進行EcoR?Ⅰ和Not?Ⅰ雙酶切，割膠回收產物與經同樣雙酶切的表達質粒pET-28a(+)連接，經熱激轉化法將pET-28a-Syxyl11導入E.coli?BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素的LB平板，經PCR篩選出陽性轉化子，送上海生工測序。測序正確的重組表達質粒命名為pET-28a-Syxyl11，陽性轉化子命名為BL21-pET-28a-Syxyl11。

(3)Syxyl11在大腸桿菌中的表達及產物純化：將陽性轉化子BL21-pET-28a-Syxyl11接種于2mL含Kan的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，以1％的接種量轉接于30mL相同培養基中，37℃振蕩培養至對數生長中期(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，在20℃誘導培養8h。將菌體沉淀，用檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖液(pH?6.0)懸浮，冰浴并超聲破碎細胞，離心得上清為粗酶液。用鎳金屬螯合層析柱純化目的蛋白。