[發明專利]一種GH11耐熱木聚糖酶基因的異源表達

無效

• 申請號: 201410758794.8
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104388450A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;何瑤;朱利娟;李劍芳;王春娟;殷欣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種來源于嗜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca)NTU22菌株糖苷水解酶第11家族(GH11)的耐熱木聚糖酶催化域優化基因(Syxyl11)，其對應的核苷酸序列和氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2。

2.SyXyl11的異源表達、酶活性及酶學特性的測定：

(1)重組質粒pUCm-T-Syxyl11的構建：根據大腸桿菌密碼子的偏好性，對來源于嗜熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶基因xyl11催化域(570bp)進行密碼子優化，并在其催化域基因兩端分別加入EcoRⅠ、NotⅠ位點，該基因命名為Syxyl11；人工合成該基因后克隆至pUCm-T質粒，轉化E.coli?JM109，經PCR驗證后送上海生工測序，獲得重組質粒pUCm-T-Syxyl11；

(2)重組表達質粒的構建：將上述得到的重組質粒pUCm-T-Syxyl11進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收產物與經同樣雙酶切的表達質粒pET-28a(+)連接，經熱激轉化法將pET-28a-Syxyl11導入E.coli?BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素(Kan)的LB平板，經PCR篩選出陽性轉化子，送上海生工測序；測序正確的重組表達質粒命名為pET-28a-Syxyl11，陽性轉化子命名為BL21-pET-28a-Syxyl11；

(3)Syxyl11在大腸桿菌中的表達、產物純化及酶學特性的測定：

將陽性轉化子BL21-pET-28a-Syxyl11接種于2mL含Kan的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，以1％的接種量轉接于30mL相同培養基中，37℃振蕩培養至對數生長中期(OD₆₀₀為0.6～0.8)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，20℃誘導培養8h。將菌體沉淀，用檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖液(pH?6.0)懸浮，冰浴并超聲破碎細胞，離心得上清為粗酶液；DNS法測得粗酶液中重組木聚糖酶活性為47.5U/mL；用鎳金屬螯合層析柱純化目的蛋白，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為24.8kDa；采用Bradford法測定蛋白含量，比酶活性為55U/mg；該酶的最適反應溫度為70℃，70℃下保溫60min，殘余酶活為78.3％；其最適pH為6.0，在pH?5.0～8.0范圍內較穩定；金屬離子對該酶活性影響較小。