[發(fā)明專利]一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410758583.4
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104388575A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設計）人: 張泉;譚海明;蔡驍垚;張文成;范乃成;王建明
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測鑒別技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，具體涉及對結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌BCG及非致病性分枝桿菌進行PCR鑒別用引物及使用該引物組合的PCR鑒別方法。

背景技術(shù)

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性消耗性傳染病，人和動物交叉感染造成該病廣泛流行，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。結(jié)核分枝桿菌復合群包括結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型和II型、caprae分枝桿菌及canettii分枝桿菌。

控制結(jié)核病的關(guān)鍵在于快速準確的診斷和嚴格淘汰。目前OIE規(guī)定(OIE?1996年頒布的《診斷試驗和疫苗標準手冊》)動物結(jié)核病的診斷和檢疫方法主要是病原分離鑒定、遲發(fā)性過敏反應試驗和血清學檢測(如淋巴細胞增生試驗、γ-干擾素試驗、ELISA)，其中血清學檢測可作為遲發(fā)性過敏反應試驗的補充。而我國2002年制定的國家標準(GB/T?18641—2002)則對OIE規(guī)定中一些在我國還無法進行的檢驗技術(shù)作了刪減(如：淋巴細胞增生試驗；γ-干擾素試驗)。牛分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified?protein?derivatives，PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應試驗為牛結(jié)核病的世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定檢驗方法，目前在世界各國廣泛采用。但不足之處也較明顯，如檢測時間偏長、耗費人力、易受牛個體和結(jié)核菌素使用量影響、容易造成主觀判斷錯誤、造成假陰性和假陽性，且短期內(nèi)不能進行復檢等缺點，另外，該方法以牛PPD為刺激原，并不能區(qū)分牛分枝桿菌感染和環(huán)境分枝桿菌的感染。

近年來，以聚合酶鏈式反應(PCR)和實時熒光定量PCR為代表的技術(shù)在結(jié)核快速檢測鑒別方面發(fā)展迅速，但多數(shù)為針對結(jié)核分枝桿菌復合群、結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌單獨菌種的方法，如周向梅等申報的一種鑒別牛分枝桿菌的PCR引物及方法(201110391925.X)，它主要是用5對引物分別針對分枝桿菌屬16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復合群RV0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7區(qū)的Rv0577基因，牛分枝桿菌pncA基因和RD1區(qū)基因進行擴增。通過擴增條帶的大小判定結(jié)果，操作步驟較多，時間較長。多重PCR技術(shù)是在同一PCR反應體系中含有多對特異性引物、同時特異性地針對不同靶區(qū)進行擴增的一種方法。國內(nèi)外已有一些多重PCR方法可以用于檢測和鑒別結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(Lee?H.R.等，2010)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復合群、鳥結(jié)核復合體及慢生長分枝桿菌(孟祥紅等，2007)；區(qū)分禽結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌等的多重PCR方法(Gopinath?K等，2009)，但至今尚無可同時檢測致病性分枝桿菌(如結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌)、卡介苗、非致病性分枝桿菌(禽結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌等)的多重PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別致病性分枝桿菌與非致病性分枝桿菌病原核酸的多重PCR引物及PCR鑒別方法。

本發(fā)明用于PCR鑒別分枝桿菌的特異性引物組合，用于鑒別分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌復合群、結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株。其能同時對分枝桿菌16S?rRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌的RV3873基因及可區(qū)分結(jié)核分支桿菌和牛結(jié)核分支桿菌的RV1506c基因進行擴增，生成特異性的擴增片段。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，包括引物組合物：16SrRNA-F：5'-acggtgggtactaggtgtgggtttc-3'、16SrRNA-R：5'-tctgcgattagcgactaagacttca-3'；RV3873-F：5'-gcgttgaccgagatggattat-3'、RV3873-R：5'-gctcatctcacccagttggc-3'；RV1506c-F：5'-ttccgaatcccttgtga-3'、RV1506c-R1：5'-ggagagcgccgttgta-3'、RV1506c-R2：5'-agtcgccgtggcttctctttta-3'。

本發(fā)明所述的引物組合物可針對分枝桿菌屬16S?rRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復合群RD1的RV3873基因和區(qū)分結(jié)核分支桿菌與牛結(jié)核分支桿菌的RV1506c基因進行同時擴增，生成特異性的擴增片段。