[發明專利]從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細菌的方法

無效

• 申請號: 201410756455.6
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104480190A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 鄭肖蘭;梁艷瓊;胡加誼;吳偉懷;習金根;鄭金龍;賀春萍;易克賢
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/125
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張洪年

技術領域

本發明屬于生物防治細菌領域，具體來說，涉及一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細菌的方法。

背景技術

橡膠樹炭疽病是橡膠樹生產中嚴重影響膠乳產量和品質的重要病害，病原菌為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides?Penz.)和尖孢炭疽菌(C.acutatum?Simmons)，膠孢炭疽菌較尖孢炭疽菌更為常見，尖孢炭疽病為我國橡膠樹新發生病害。橡膠樹炭疽病為害導致葉片組織壞死或大量脫落，嚴重時造成大量落葉和嫩梢回枯，樹體衰弱，縮短割膠期限，推遲開割時間，使橡膠總產量顯著下降。

目前，國內外對橡膠炭疽病開展了一系列研究，主要集中在病害流行及藥劑篩選方面。崔昌華等(2006)采用菌落生長速率法在室內進行橡膠樹炭疽病菌對三唑酮、丙環唑、百菌清、代森鋅、多菌靈5種藥劑的敏感性測定。蔡志英等(2008)采用生長速率法室內測定了云南省橡膠炭疽病菌膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對咪鮮胺、多菌靈、甲基托布津、溴菌腈、百菌清和代森錳鋅的敏感性。鄭肖蘭(2008)采用菌落生長速率法測定了18種橡膠炭疽病菌菌株對保治達等4種常用真菌性藥劑的敏感性。王蘭英等(2010)研究報道了8種殺菌劑對橡膠炭疽菌孢子萌發的抑制活性。然而，生產上對于橡膠炭疽病的防治仍以化學殺菌劑為主，而化學農藥造成的病菌抗藥性、毒性和環境污染問題日益突出，已經成為制約農業可持續發展的主要障礙。因此，亟待需要尋找一種具有環境兼容性好、無毒無害的生防微生物，作為化學農藥的理想替代品。

發明內容

本發明的目的是提供一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細菌的方法，包括以下步驟：

(1)采集橡膠感病葉片；

(2)用升汞浸泡葉片，然后用無菌水沖洗；

(3)將葉片放在PDA培養基上，28℃培養48h后將長出的菌體轉接至相同的培養基上，28℃培養48h后純化；同時，將純化后所得的細菌采用梯度稀釋涂布LB平板培養基中，28℃培養48h后挑取單菌落接至相應培養基斜面上；

(4)將單菌落28℃震蕩培養約12小時，吸取少量置于LB固體培養基上，涂抹均勻，28℃培養；然后通過無限稀釋法處理獲得單一菌株；

(5)從菌株中篩選出細菌，轉接到LB平板，用涂布平板法得到單菌落；對獲得的單菌株與供試菌橡膠樹炭疽菌RC178進行對峙培養；

(6)通過觀察有無抑菌圈，挑選出現抑菌圈的拮抗細菌。

在一個具體的實施方式中，步驟(1)為：采集不同來源的橡膠感病葉片，清水沖洗；并且剪取大小為5×5mm的小葉片備用。

在一個具體的實施方式中，步驟(2)為：將剪取的小葉片用升汞浸泡30秒，然后用無菌水沖洗3次，晾干。

在一個具體的實施方式中，步驟(3)為：用滅過菌的鑷子將剪取的小葉片貼放到PDA固體培養基上，每皿均勻擺放4塊，再將培養皿用保鮮膜密封。倒置放入恒溫培養箱中，28℃培養。每隔12h進行觀察48h后將長出的菌體轉接至相同的培養基上，28℃培養48h后進行純化；同時，將純化后所得的細菌采用梯度稀釋涂布LB平板培養基中，28℃培養48h后挑取單菌落接至相應培養基斜面上。

在一個具體的實施方式中，步驟(4)為：將放置于8～10℃培養箱中的斜面試管取出。在無菌操作臺中，將液體LB培養基分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細菌于錐形瓶中，封口。放置于28℃搖床上震蕩培養約12小時，取出。然后再通過無限稀釋法處理獲得單一菌株。

在一個具體的實施方式中，PDA培養基配方為：馬鈴薯200g/L、葡萄糖或蔗糖10g/L、瓊脂18g/L。

在一個具體的實施方式中，LB培養基配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl?10g/L，pH＝7；在上述配方中加入瓊脂形成LB固體培養基。

與現有技術相比，本發明的分離篩選方法具有以下有益效果：

(1)本發明方法很容易得到新的拮抗細菌菌株，該菌株對橡膠樹炭疽菌RC178具有十分明顯的拮抗作用；它常用作生防菌，有望制成微生物制劑，為橡膠樹炭疽病生物防治提供基礎準備。

(2)使用本發明方法得到的拮抗細菌菌株可以大幅度的減少化學農藥對環境帶來的污染，同時，可以達到控制病害發生的目的。

附圖簡介

圖1顯示了拮抗細菌與RC178對峙圖。

圖2顯示了拮抗細菌的菌落形態和孢子形態。

具體實施方式