[發明專利]從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細菌的方法

無效

• 申請號: 201410756455.6
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104480190A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 鄭肖蘭;梁艷瓊;胡加誼;吳偉懷;習金根;鄭金龍;賀春萍;易克賢
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/125
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張洪年

1.一種從橡膠樹葉片中分離篩選拮抗細菌的方法，包括以下步驟：

(1)采集橡膠感病葉片；

(2)用升汞浸泡葉片，然后用無菌水沖洗；

(3)將葉片放在PDA培養基上，28℃培養48h后將長出的菌體轉接至相同的培養基上，28℃培養48h后純化；同時，將純化后所得的細菌采用梯度稀釋涂布LB培養基中，28℃培養48h后挑取單菌落接至相應培養基斜面上；

(4)將單菌落28℃震蕩培養約12小時，吸取少量置于LB固體培養基上，涂抹均勻，28℃培養；然后通過無限稀釋法處理獲得單一菌株；

(5)從菌株中篩選出細菌，轉接到LB平板，用涂布平板法得到單菌落；對獲得的單菌株與供試菌橡膠樹炭疽菌RC178進行對峙培養；

(6)通過觀察有無抑菌圈，挑選出現抑菌圈的拮抗細菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述PDA培養基配方為：馬鈴薯200g/L、葡萄糖或蔗糖10g/L、瓊脂18g/L。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述LB培養基配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl?10g/L，pH＝7；在上述配方中加入瓊脂形成LB固體培養基。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟(4)的震蕩培養為：將放置于8～10℃培養箱中的斜面試管取出，在無菌操作臺中，將液體LB培養基分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細菌于錐形瓶中，封口；放置于28℃搖床上震蕩培養約12小時，取出。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其中所述步驟(5)的對峙培養為：用涂布平板法得到單菌落，供試菌株RC178用無菌打孔器打取直徑為6mm的菌餅，置于直徑為90mm的平板中間，在圍繞RC178十字交叉的4個角落分別接種經過初篩的多個菌株，每個菌株3個重復，用保鮮膜封上培養皿以防污染；采用點線處理法和其他對峙形式，進行對峙培養；以只接病原菌，不接分離菌株為對照。