[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410752557.0
• 申請(qǐng)日: 2014-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN104404121A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 元英進(jìn);王恩旭;丁明珠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P39/00
• 分類號(hào): C12P39/00;C12P7/60;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)維生素C的方法，尤其是涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體2-酮基-L-古龍酸的方法及相關(guān)發(fā)酵菌株。

背景技術(shù)

維生素C(Vitamin?C,VC)，又名L-抗壞血酸(L-ascorbic?acid)，是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)。維生素C為抗體及膠原形成，組織修補(bǔ)(包括某些氧化還原作用)，苯丙氨酸、酪氨酸、葉酸的代謝，鐵、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白質(zhì)的合成，維持免疫功能，羥化與羥色胺，保持血管的完整，促進(jìn)非血紅素鐵吸收等所必需，維生素C作為一種抗氧化劑，在人體的氧化還原代謝反應(yīng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)維生素C還具備抗自由基、抑制酪胺酸酶的形成，從而達(dá)到美白，淡斑的功效。

目前有多種人工合成維生素C的方法，如：串聯(lián)發(fā)酵法、利用歐文氏菌一步發(fā)酵法、Reichstein發(fā)明的萊氏化學(xué)合成法，以及尹光琳二步發(fā)酵法。其中尹光琳發(fā)明的二步發(fā)酵法是20世紀(jì)70年代，由中科院北京微生物所的尹光琳等人利用一種混合微生物發(fā)酵體系，將原有萊氏法中的三步化學(xué)反應(yīng)縮短為一步生物反應(yīng)，以生物氧化代替化學(xué)氧化，既避免了大量易燃、易爆或有毒化學(xué)原料的使用，同時(shí)也大大縮短了工藝流程、降低了生產(chǎn)成本，成為現(xiàn)階段工業(yè)生產(chǎn)維生素C最主要的工藝。此法首先用一步菌氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter?oxydans,Go)將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖；然后用二步混菌將L-山梨糖高效地轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸(2-Keto-L-Gulonic?acid，2-KGA)；最后再用與Reichstein法類似的化學(xué)法轉(zhuǎn)化為維生素C。其中，第二步所用的混菌體系由兩種菌組成，一種是產(chǎn)酸菌-酮古龍酸桿菌(Ketogulonigenium?vulgare,Kv)，行業(yè)內(nèi)俗稱小菌；另一種是伴生菌，行業(yè)內(nèi)俗稱大菌，伴生菌的種類較多，如：蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus,Bc)、巨大芽孢桿菌(Bacil1us?megaterium,Bm)、蘇蕓金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis,Bt)等。

雖然現(xiàn)有維生素C的生產(chǎn)體系已經(jīng)很成熟，但是因其兩步發(fā)酵而必然導(dǎo)致能耗大，總發(fā)酵周期較長(zhǎng)，即生產(chǎn)成本較高。然而隨著維生素C市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈，如何降低生產(chǎn)成本，提高維生素C的收率，是企業(yè)能否在激烈的競(jìng)爭(zhēng)中搶占有利制高點(diǎn)的關(guān)鍵，故此對(duì)現(xiàn)有發(fā)酵工藝的優(yōu)化已成為研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)兩步發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵周期長(zhǎng)、能耗大、生產(chǎn)成本高的缺陷，提供一種發(fā)酵周期短的發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的方法。采用本發(fā)明所述方法發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，發(fā)酵周期短，能耗小，生產(chǎn)成本低。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的方法，將氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter?oxydans)與酮古龍酸桿菌(Ketogulonigenium?vulgare)混合，以山梨醇作為碳源，發(fā)酵制備2-酮基-L-古龍酸。

在一些實(shí)施方案中，所述氧化葡萄糖酸桿菌與所述酮古龍酸桿菌的混合比例為10:1-1:10。

在一些實(shí)施方案中，所述氧化葡萄糖酸桿菌中山梨糖/山梨醇旁路代謝相關(guān)基因被敲除。

在一些實(shí)施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代謝相關(guān)基因?yàn)镚ene?Bank中基因序號(hào)為B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一種或幾種。

在一些實(shí)施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代謝相關(guān)基因?yàn)镚ene?Bank中基因序號(hào)為B932_1330的基因。

在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的方法中，所述發(fā)酵的具體方法為：發(fā)酵罐按裝料系數(shù)60％-80％裝發(fā)酵培養(yǎng)基；以山梨醇計(jì)初始投入料為4％，3h后開始流加剩余4％；在培養(yǎng)溫度25℃-33℃、攪拌速度400rpm-600rpm、通氣量1.0vvm-1.5vvm條件下發(fā)酵20h-50h。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵的具體方法為：發(fā)酵罐按裝料系數(shù)60％裝發(fā)酵培養(yǎng)基；以山梨醇計(jì)初始投入料為4％，3h后開始流加剩余4％；在培養(yǎng)溫度30℃、攪拌速度500rpm、通氣量1.5vvm條件下發(fā)酵28h。