[發明專利]利用CRISPR-Cas9系統敲除動物FGF5基因的方法

有效

• 申請號: 201410751079.1
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104531704B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 侯健;厲建偉;安曉榮
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明提供了一種利用CRISPR?Cas9系統敲除動物FGF5基因的方法。本發明首先獲得針對FGF5第二外顯子的sgRNA識別區的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示；接著構建FGF5第二外顯子的sgRNA表達結構，并將T7啟動子插入sgRNA轉錄起始位點前，同時構建Cas9蛋白的體外轉錄載體，以T7啟動子調控。利用Cas9和sgRNA的體外轉錄載體獲得Cas9 mRNA和sgRNA，可用于生產敲除FGF5基因的動物。

技術領域

本發明屬于動物基因工程和遺傳修飾領域，具體地說，涉及一種利用CRISPR-Cas9表達系統敲除動物FGF5基因的方法。

背景技術

自上世紀80年代基因工程興起以來，大量基因編輯技術出現以滿足科研需要，其中的基因打靶技術是一種在高等動物中對基因進行定點精細修飾的技術。傳統基因打靶技術依賴體內自發的同源重組(HR,homologous recombination)，效率大約只有1/10⁶。近年來為了解決同源重組效率低下的問題，人們通過人工構建的雜合分子對特定的DNA序列進行切割，以此來提高基因打靶的效率，其中以核酸內切酶為核心的人工復合分子最受關注。

FGF5基因是成纖維細胞生長因子家族的成員。FGF5基因突變型的小鼠和兔子據有被毛變長的表型，且與野生型相比較無其他性狀的差異。研究已證明FGF5引起被毛變長是由于其影響毛囊周期性活動，通過使毛囊生長IV期延長，從而導致被毛較野生型更長。因而FGF5基因突變在產毛類動物上具有很大的實用價值，且并不會影響動物的其他性狀及產品質量。在大型產毛類哺乳動物如綿羊、山羊等物種中進行傳統的基因打靶，其效率很低，為此有必要尋找更好的基因打靶技術進行應用性生產。

CRISPR/Cas9系統包括一個具備DNA結合和切割的Cas9蛋白以及負責特異性識別DNA序列并引導Cas9蛋白特異性結合到目的DNA位點的sgRNA。在動物體內，Cas9蛋白與sgRNA首先結合成一個蛋白復合體，然后通過sgRNA的特異性識別作用，在基因組中識別到特定的目標DNA序列并一到蛋白復合體結合到DNA鏈上。然后通過Cas9的核酸內切酶活性在目標位點將DNA切開，形成一個DNA雙鏈斷裂(DSB)。通過誘導自體的DNA修復機制發揮作用，如同源重組或非同源末端連接(NHEJ，Non-homologous end joining)，從而在該位點產生基因突變，從而到達基因打靶的目的。

與傳統的同源重組介導的基因打靶相比較，利用CRISPR/Cas9系統對哺乳動物進行基因打靶具有操作簡便，效率高，適用物種廣泛等優點，尤其可以一次性的實現多基因打靶，這在動物遺傳修飾及疾病模型研究中都有極其廣闊的應用前景。

傳統的基因打靶技術依賴生物體內自發的同源重組現象，因而效率很低，隨著技術發展后來便出現了鋅指核酸酶(ZFNs，zinc finger nucleases)和轉錄激活子樣效應子介導核酸酶(TALENs，transcription activator-like effector nucleases)。這兩種系統結構比較相似，每個蛋白分子都是由FolkI核酸內切酶結構域和DNA識別結構域兩部分構成，通過每個蛋白分子中的特異性DNA識別域識別基因組中的特定目的序列，從而將FolkI內切酶定位至靶位點。由于FolkI核酸內切酶需要在DNA雙鏈上形成二聚體形式才能發揮核酸內切酶的功能，因而ZFNs和TALENs在基因打靶時都需要兩個分子分別定位在靶位點的兩條DNA鏈上，才可以發揮核酸內切酶的作用，對DNA進行切割產生雙鏈斷裂(DSB).