[發明專利]利用CRISPR-Cas9系統敲除動物FGF5基因的方法

有效

• 申請號: 201410751079.1
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104531704B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 侯健;厲建偉;安曉榮
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.利用CRISPR-Cas9表達系統敲除動物FGF5基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構建特異性靶向FGF5基因第二外顯子的sgRNA的表達載體；通過體外轉錄表達得到FGF5基因第二外顯子sgRNA，所述sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)構建Cas9蛋白的體外轉錄載體，得到Cas9mRNA；所述Cas9蛋白的體外轉錄載體的構建方法為：1)以內切酶AgeI和NotI酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9獲得pX330載體中的Cas9表達區段；2)以AgeI和NotI線性化載體pIRES-puro3；3)將兩端序列連接獲得終載體pCas9-puro3

(3)將步驟(1)的sgRNA和步驟(2)的Cas9mRNA純化后，混合，注射入動物受精卵細胞質或細胞核中，然后經體外短時培養后移植入同種雌性動物輸卵管中，或體外培養至囊胚期移植到同種雌性動物子宮中，以生產敲除FGF5基因的動物；

所述動物為小鼠，豬，牛，綿羊，山羊。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，sgRNA與Cas9mRNA混合后，sgRNA和Cas9mRNA的質量比為1:10～1:2。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，sgRNA與Cas9mRNA混合后二者質量比為1:7.5。

4.權利要求1-3任一所述的方法在制備敲除FGF5基因的動物中的應用。