[發(fā)明專利]一種基因工程菌及其構(gòu)建方法和在生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410750635.3
• 申請(qǐng)日: 2014-12-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104593308A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳綿斌;蘇卜利;張哲;林建平;楊立榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基因工程菌及其構(gòu)建方法和在生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用

背景技術(shù)

目前工業(yè)上生產(chǎn)木糖醇主要是在高溫高壓條件下用鎳催化木糖加氫制得，這種工藝需要條件苛刻，且容易造成污染，所以生物法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇越來(lái)越受到人們的重視。用于發(fā)酵法制備木糖醇的微生物幾乎都是酵母菌，既有自然菌種，也有基因工程菌。酵母菌作為木糖醇生產(chǎn)菌株有著自己的優(yōu)勢(shì)，比如能耐受較高的糖濃度，對(duì)半纖維素水解液中的抑制因子抵抗性較強(qiáng)，等等。但是也存在不可回避的問(wèn)題，主要體現(xiàn)在：(1)目前主要產(chǎn)木糖醇的酵母是熱帶假絲酵母，其具有潛在的致病性，并不適合食品的生產(chǎn)；(2)酵母本身所含有的木糖還原酶專一性較差，對(duì)木糖和阿拉伯糖都有較高的催化效率，這樣一來(lái)利用半纖維素水解液轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇的時(shí)候，必然會(huì)有大量阿拉伯糖醇的產(chǎn)生，導(dǎo)致下游分離困難，增加生產(chǎn)成本；(3)在利用其它重組酵母如釀酒酵母生產(chǎn)木糖醇時(shí)，因?yàn)槠錄](méi)有專一性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，木糖吸收速率較慢所以生產(chǎn)效率較低。

公開(kāi)號(hào)為CN101497904A的中國(guó)專利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種同時(shí)生產(chǎn)木糖醇與阿拉伯糖的方法，該方法利用假絲酵母發(fā)酵半纖維素水解液聯(lián)產(chǎn)阿拉伯糖和木糖醇，該工藝著眼于資源的綜合利用，有較好的應(yīng)用前景，但是絕大數(shù)半纖維素水解液中阿拉伯糖的含量?jī)H有木糖含量的十分之一左右，導(dǎo)致發(fā)酵母液中阿拉伯糖含量不高，而且阿拉伯糖與木糖醇又需要一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的分離過(guò)程，這樣會(huì)增加了木糖醇的生產(chǎn)成本。

大腸桿菌作為當(dāng)前研究最為透徹，基因背景最清楚的菌株，利用其構(gòu)建基因工程菌有著得天獨(dú)厚的條件，其有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，基因操作相比酵母非常簡(jiǎn)單，蛋白表達(dá)水平高等諸多優(yōu)點(diǎn)，而且在安全性問(wèn)題上美國(guó)FDA也批準(zhǔn)了以大腸桿菌K12為出發(fā)菌株的重組菌用于生物醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)。但大腸桿菌在表達(dá)蛋白的時(shí)候也有一定的缺陷，即在較高溫度下很容易形成包涵體。

公開(kāi)號(hào)為PCT/US2011/021277的美國(guó)專利利用大腸桿菌工程菌株進(jìn)行流加發(fā)酵時(shí)，利用160g木糖可產(chǎn)生156g木糖醇，濃度達(dá)到136g/L，生產(chǎn)速率為1.92g/L/h；在利用脫毒后的半纖維素水解液進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，利用50.6g木糖可生產(chǎn)46g木糖醇，生產(chǎn)速率為0.56g/L/h。該文獻(xiàn)報(bào)道的研究雖然已經(jīng)是目前重組大腸桿菌生產(chǎn)木糖醇的最高水平，但還沒(méi)有充分發(fā)揮大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的潛力，其底物濃度、產(chǎn)物濃度及生產(chǎn)效率還不能和酵母相媲美。

由于發(fā)酵過(guò)程中，即使在初期沒(méi)有包涵體產(chǎn)生，但隨著時(shí)間推移也會(huì)產(chǎn)生包涵體，隨著蛋白與包涵體不斷聚集，沒(méi)有活性的目的蛋白會(huì)越來(lái)越多。現(xiàn)有含有木糖還原酶基因的大腸桿菌工程菌株，為防止發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的包涵體，一般需在較低溫度下進(jìn)行發(fā)酵，如在26℃左右進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在18℃左右進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵。但大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)溫度在37℃，在如此低的溫度下發(fā)酵，細(xì)胞生長(zhǎng)速度就會(huì)降低，同時(shí)木糖還原酶的催化效率也會(huì)受低溫影響。因此構(gòu)建一個(gè)在較高溫度下沒(méi)有包涵體產(chǎn)生的表達(dá)載體對(duì)木糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)而言是至關(guān)重要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基因工程菌，利用該基因工程菌生產(chǎn)木糖醇，可以大幅度提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

一種基因工程菌，包括大腸桿菌和轉(zhuǎn)入大腸桿菌的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游插入有木糖還原酶基因，所述木糖還原酶基因的堿基序列如SEQ?ID?No.4所示。

本發(fā)明對(duì)NCBI登錄號(hào)為NCU08384.1的木糖還原酶基因中的兩個(gè)密碼子(起始密碼子后的第一、三個(gè)密碼子)進(jìn)行同義突變，獲得具有不同翻譯效率(the?translation?initiation?rate)的木糖還原酶基因，并從中選取了SEQ?ID?No.4所示的木糖還原酶基因(其翻譯效率為6689.5)，該基因能在30℃的較高溫度下獲得高效表達(dá)，并且?guī)缀鯖](méi)有包涵體產(chǎn)生。

該木糖還原酶基因若在T7等強(qiáng)啟動(dòng)子下表達(dá)，發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行到中后期后仍舊會(huì)有較多的包涵體產(chǎn)生，導(dǎo)致酶活迅速降低。因此本發(fā)明中，作為優(yōu)選，所述啟動(dòng)子為Trc啟動(dòng)子，所述木糖還原酶基因的5’端帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)的堿基序列為：

5’-AGAAGGAGATATACAT-3’。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在該核糖體結(jié)合位點(diǎn)和Trc啟動(dòng)子的引發(fā)下，木糖還原酶基因仍能在30℃的較高溫度下獲得高效表達(dá)，并且?guī)缀鯖](méi)有包涵體產(chǎn)生。

作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體為pTrc99a。pTrc99a自帶有Trc啟動(dòng)子，不必額外地將Trc啟動(dòng)子連接到表達(dá)載體中。