[發明專利]利用交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛肉源成分的方法

有效

• 申請號: 201410750537.X
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104388573A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 李素芳;楊韓;潘家榮;張雪妍;馮濤;朱月城;董圣祿;何巧
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京修典盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 胡長遠

技術領域

本發明屬于食品質量控制檢測方法領域，具體涉及用于交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛肉源成分的引物組，以及含有該引物組的檢測試劑盒，還涉及利用交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛肉源成分的方法。

背景技術

肉制品是人體蛋白質的重要來源。不同動物源的肉品質、價格上存在較大差異，由于利益的驅動，不法商人肉摻假現象時有發生，嚴重損害消費者利益，也帶來食品安全問題。對動物源性成分進行現場檢測，是解決肉摻假市場監管問題的有效方法。

牛肉相對于鼠肉和兔肉價格較高，是被摻假的對象之一。目前，對于牛肉源成分的區分和鑒定主要是利用核酸序列的特異性，即利用核酸擴增技術。常規PCR檢測和熒光定量PCR檢測是應用最廣的核酸擴增技術，但是PCR技術需要PCR儀或熒光定量PCR儀，主要適合在實驗室，而不利于在基層實驗室推廣應用等(羅家琴等,中國農業科學.2008,41(7):2112-2119；Kaur?J等.2010,21(11):1536–1544.doi:10.1016/j.foodcont.2010.03)。

動物種源的定性檢測要求所建立的體系具有較高的靈敏度，進而可檢測到樣品中某種動物源的存在與否。因此，目前的定性檢測研究多將目的片段定位于多拷貝基因，例如線粒體基因，多數細胞皆含大量線粒體，且每個線粒體中含數拷貝線粒體DNA，從而可使檢測限達到較低水平，提高靈敏度。分析比對鼠、牛、羊上的線粒體基因組序列，本發明選用具有牛屬代表性的線粒體基因組中的ATP8基因作為檢測牛屬的目標核酸序列。

交叉引物恒溫擴增技術(Crossing?Priming?Isothermal?Amplification，CPA)(專利號為：ZL200810134583.1)是杭州優思達生物技術公司結合了恒溫核酸擴增技術和核酸試紙條快速檢測技術而發明的一種操作簡單、時間短、成本低的檢測技術，已廣泛用于病原體檢測等領域。該技術還具有特異性強、靈敏度高的特點，特別適合用于現場檢測。目前該技術結合膠體金核酸試紙條的檢測方法已被用在諸如沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、結核分歧桿菌、惡性瘧疾、霍亂弧菌、志賀氏菌、瓜果類斑病菌等病原菌的檢測(祁軍等.食品研究開發，2013,34(2):67-70；祁軍等.中國媒介生物學及控制雜志，2013,24(3):204-207)。

經檢索，沒有發現交叉引物恒溫擴增技術用于動物肉源檢測方面的報道。

發明內容

針對目前動物源成分檢測中存在的需要專門儀器設備和專門技術人才、檢測方法復雜和檢測速度慢等問題，本發明目的在于提供用于交叉引物和雙探針恒溫擴增核酸序列檢測牛源性成分的引物組。

本發明另一目的在于提供利用交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛源性成分的試劑盒。

本發明第三目的在于提供利用交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛源性成分的方法。

實現本發明的技術方案如下：

本發明用于交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛源性成分的引物組，由一對外圍引物、一對交叉引物和一對檢測探針引物組成；

其中所述的一對外圍引物為：

正向外圍引物BOS4s：5’-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3’(SEQ?ID?No:1)，

反向外圍引物BOS5a：5’-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3’(SEQ?ID?No:2)，

所述的交叉引物為：

正向交叉引物BOS2a1s：

5’-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3’(SEQ?ID?No:3)，

反向交叉引物BOS1s2a：

5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ?ID?No:4)，

所述一對檢測探針引物為：

檢測探針引物BOS1s2a*：

5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ?ID?No:5)，

檢測探針引物BOSHP*：5’-ATTTCCAACACAAAACT-3’(SEQ?ID?No:6)；

其中BOS1s2a*的5’端標記修飾生物素，BOSHP*的5’端標記修飾熒光素FAM。