[發明專利]利用交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛肉源成分的方法

有效

• 申請號: 201410750537.X
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104388573A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 李素芳;楊韓;潘家榮;張雪妍;馮濤;朱月城;董圣祿;何巧
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京修典盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 胡長遠

1.用于交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛源性成分的引物組，其特征在于由一對外圍引物、一對交叉引物和一對檢測探針引物組成；

其中所述的一對外圍引物為：

正向外圍引物BOS4s：5’-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3’(SEQ?ID?No:1)，

反向外圍引物BOS5a：5’-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3’(SEQ?ID?No:2)；

所述的交叉引物為：

正向交叉引物BOS2a1s：

5’-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATT?G-3’(SEQ?ID?No:3)，

反向交叉引物BOS1s2a：

5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTT?GA-3’(SEQ?ID?No:4)，

所述一對檢測探針引物為：

檢測探針引物BOS1s2a*：

5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ?ID?No:5)，

檢測探針引物BOSHP*：5’-ATTTCCAACACAAAACT-3’(SEQ?ID?No:6)；

其中BOS1s2a*的5’端標記修飾生物素，BOSHP*的5’端標記修飾熒光素FAM。

2.利用交叉引物和雙探針恒溫擴增檢測牛源性成分的試劑盒，其特征在于包括下列6個部分，分別為核酸檢測試紙條、SSC緩沖液、恒溫擴增反應液、Bst?DNA聚合酶液、無菌雙蒸水以及陽性對照；其中所述的恒溫擴增反應液(A管)括權利要求1所述的一對外圍引物、一對交叉擴增引物和一對檢測探針引物，以及Thermol?pol?buffer和dNTPs溶液。

3.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的恒溫擴增反應液(A管)的組成成分及其比例為：正向外圍引物BOS4s?0.125μmol/L，反向外圍引物BOS5a?0.125μmol/L，正向交叉引物BOS2a1s?1μmol/L，反向交叉引物BOS1s2a?0.5μmol/L，檢測探針引物BOS1s2a*0.5μmol/L，檢測探針引物BOSHP*0.5μmol/L，dNTPs溶液0.25mmol/L，Betiane甜菜堿0.25M，1×Thermol?pol?buffer。

4.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的核酸檢測試紙條是指3號核酸檢測試紙條。

5.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的SSC緩沖液的組成成分及其比例為：0.3mol/L?NaCl,0.03mol/L檸檬酸鈉,用1mol/L?HCl調節pH至7.0。

6.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的1×Thermol?pol?buffer的組成成分及其比例為：10mM?KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM?Tris-HCl、2mM?MgSO4、0.1％TritonX-100、pH8.8。

7.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的Bst?DNA聚合酶液(B管)為Bst?DNA聚合酶液(8U/μL)。

8.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的陽性對照(D管)為含有牛線粒體ATP8基因片段的質粒DNA；所述的牛線粒體ATP8基因片段由SEQ?ID?No:9所示的核苷酸序列組成。