[發明專利]利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法

在審

• 申請號: 201410750077.0
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN104388458A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 畢玉平;邊斐;張曉瑋;彭振英;鄭玲;陳高;于金慧
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/17;C07K14/62
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

1.一種利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，

（1）對人源PI基因進行了密碼子優化，合成了經過密碼子優化的基因；

（2）設計引物，PCR擴增后，將經過密碼子優化的基因融合TrxA蛋白構建融合表達載體；

（3）轉入大腸埃希氏菌NKYBYP表達菌株，發酵；?

（4）將發酵后的菌體超聲破碎，分離純化上清液中TrxA-PI融合蛋白；?

（5）融合蛋白經腸激酶酶切、親和層析純化后獲得PI純品。

2.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，步驟（1）中將人源PI基因的密碼子優化為E.coli?偏愛密碼子，經過密碼子優化的基因序列為：

ATGGCACTGTGGATGCGTCTGCTGCCGCTGCTGGCCCTGCTGGCCCTGTGGGGTCCGGATCCAGCCGCAGCATTCGTTAATCAGCATCTGTGTGGCAGCCATCTGGTGGAAGCGCTGTATCTGGTTTGCGGTGAACGTGGCTTTTTCTATACCCCGAAAACCCGTCGTGAAGCGGAAGATCTGCAGGTGGGCCAGGTGGAACTGGGTGGCGGTCCAGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCACTGGCGCTGGAGGGCAGCCTGCAAAAGCGTGGCATTGTGGAACAGTGCTGCACCAGCATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAACTATTGTAAT。

3.?根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，步驟（2）中設計引物，含NcoI?和Xho?I酶切位點的引物如下：

5’-3’?ATCCATGGCATTCGTTAATCAGCATCTGTGTG

3’-5’?CGCGCTCGAGTTATCAATTACAATAGTTTTCCAGC

以合成的含PI基因的質粒為模板，?PCR擴增獲得經過密碼子優化的PI基因。

4.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，步驟（2）中，PCR產物用限制性內切酶NcoI?和Xho?I?酶切后，連接到被同樣酶切過的表達載體pET-32a上，構建融合表達載體pET-32a-PI。

5.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，步驟（3）中所述大腸埃希氏菌Escherichia?coli?NKYBYP，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是：CGMCCNo.9979，保藏日期為2014年11月17日。

6.根據權利要求1所述的一種利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，步驟（3）中發酵過程為:

①將測序驗證后的質粒轉入菌株大腸埃希氏菌NKYBYP，挑取平板上的單克隆至LB培養基中培養，培養基中添加終濃度100?μg/ml的Amp、15?μg/ml的Kan，12.5?μg/ml的Tet，34?μg/ml的Chl；

②將步驟①培養好的菌液按1%接種量接種至擴大培養基中，37℃，200?rpm擴大培養；

③當OD₆₀₀＝0.8時加入終濃度0.2?mM?IPTG，在25℃，160?rpm誘導8?h。

7.根據權利要求1所述的利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，步驟（4）中11000?rpm離心2分鐘收集菌體，用三蒸水洗滌菌體2次，加入Binding?buffer溶解菌體，超聲破碎，超聲破碎條件：功率350瓦，超聲5秒，間隔10秒，超聲30次直至菌體澄清；11000?rpm離心10分鐘，從上清液中提取融合蛋白。

8.根據權利要求7所述的利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性胰島素原的方法，其特征在于，Binding?buffer為0.5?M?NaCl,20?mM?Tris-HCl,5?mM?imidazole,pH?8.0。