[發(fā)明專利]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性胰島素原的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410750077.0
• 申請(qǐng)日: 2014-12-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104388458A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 畢玉平;邊斐;張曉瑋;彭振英;鄭玲;陳高;于金慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/17;C07K14/62
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及可溶性胰島素原制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性胰島素原的方法。?

背景技術(shù)

糖尿病（Diabetes?mellitus,?DM）是多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，是由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏或靶組織對(duì)胰島素不敏感而引起的綜合病癥，是環(huán)境和遺傳兩個(gè)因素長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果。根據(jù)世衛(wèi)組織（WHO）預(yù)測(cè)，2020年以后全世界糖尿病患者人數(shù)可能突破4個(gè)億。糖尿病因其病因復(fù)雜，并發(fā)癥多，治愈率低，成為國(guó)際國(guó)內(nèi)一大醫(yī)學(xué)難題，也帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問(wèn)題，被WHO稱為不死的癌癥。糖尿病的治療藥物有很多種，胰島素在糖尿病治療中具有無(wú)可替代的作用和地位，是最直接最有效的治療糖尿病藥物之一，胰島素制劑現(xiàn)在已占到了整個(gè)糖尿病用藥30%以上的市場(chǎng)份額。

人胰島素（human-insulin,?HIN）是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激動(dòng)而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。在人的β細(xì)胞細(xì)胞核中，第11對(duì)染色體短臂上胰島素基因區(qū)DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上翻譯成前胰島素原（Preproinsulin）；前胰島素原通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時(shí)，被信號(hào)肽酶切去N端信號(hào)肽，生成胰島素原（Proinsulin，PI），同時(shí)PI分子內(nèi)形成3個(gè)二硫鍵；PI隨胞漿中的微泡進(jìn)入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，斷裂生成沒(méi)有作用的C肽，同時(shí)生成胰島素（Insulin）分泌到β細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)作為一種激素行使降血糖的功能。

人的Preproinsulin由110個(gè)氨基酸殘基組成。由N端至C端連接順序?yàn)镾-B-Arg-Arg-C-Lys-Lys-A，其中S：signal?peptide信號(hào)肽，24個(gè)氨基酸殘基；C：C肽，31個(gè)氨基酸殘基，不同種屬動(dòng)物的C肽不同；A和B分別為胰島素的A鏈（21個(gè)氨基酸）和B鏈（30個(gè)氨基酸）。整個(gè)PI分子含有3?對(duì)二硫鍵,?其中2?對(duì)鏈間二硫鍵(?A6－B6,?A20－B19)?位于B?鏈和A?鏈之間，1?對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵(?A6－A11)?位于A?鏈內(nèi)部。

早期用于臨床的Insulin幾乎都是從豬、牛胰臟中提取的。由于Insulin需求量巨大，促使人們不斷改進(jìn)工藝和采用新的技術(shù)成果生產(chǎn)Insulin。DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)為Insulin的生產(chǎn)開(kāi)創(chuàng)了新的途徑。近幾十年來(lái)，基于對(duì)Insulin分子結(jié)構(gòu)及功能更加深入的了解，人們不僅實(shí)現(xiàn)了人胰島素在大腸桿菌（Escherichia?coli）中的生物合成并推向市場(chǎng)，而且PI及其類似物基因在許多系統(tǒng)如畢赤酵母（Biotechnol?Appl?Biochem,?1999,?29:78-86;?Biotechnol?Bioeng,?2001,73:74-79）、釀酒酵母（Appl?Microbiol?Biotechnol,?2000,?54:?277-286;?J?Biol?Chem,?2002,?277:?18245-18248）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（Sci?Rep,?2014,?4:?6465）、轉(zhuǎn)基因植物（Nat?Biotechnol?1998,16:934-938;?Plant?Biotech?J,?2006,?4:?77-85;?Plant?Biotech?J,?2011,?9:?585-598;?Genet?Mol?Res,?2010,?9?:1163-1170;?Jundishapur?J?Nat?Pharm?Prod,?2014,?9:?9-15）中都得到了表達(dá)。現(xiàn)在上市的基因工程Insulin主要有2種生產(chǎn)工藝，分別為美國(guó)禮來(lái)公司（Eli?Lilly?and?Company）的E.coli表達(dá)系統(tǒng)和丹麥諾和諾德公司（Novo?Nordish）的酵母表達(dá)系統(tǒng)。1998年12月，我國(guó)通化東寶藥業(yè)利用E.coli表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組HIN填補(bǔ)了我國(guó)能夠生產(chǎn)及銷售重組Insulin藥物的空白，成為中國(guó)最大的重組HIN生產(chǎn)廠家。