[發明專利]基于飛行時間質譜法聯合特異Tags序列進行SNP分型方法的建立(MS-SSTA)

在審

• 申請號: 201410749355.0
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN105734118A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 梁海泳;王姝杰
• 申請（專利權）人: 博淼生物科技（北京）有限公司;王姝杰
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本方法MS-SSTA(MSBasedSiteSpecificTagsAssay)涉及到使用飛行時間質譜分析生物核酸分子中單核苷酸多態性（SNP，SingleNucleotidePolymorphisms）。具體來說，是引入一段特異性的Tags序列，經過一系列的寡核苷酸連接反應、PCR反應、限制性酶切反應等，然后使用飛行時間質譜對基因組的單核苷酸多態性進行檢測。

背景技術

SNP是指在基因組上單個核苷酸的變異，包括轉換、顛換、缺失和插入等變化，且在群體中的發生頻率不小于1%，它與許多疾病的易感性和藥物反應差異有關。SNP具有數量多、分布廣、遺傳穩定等特點，在人類基因組中大概每1000個堿基平均就有一個SNP，人類基因組上的SNP總數大概是300萬個，存在于基因組的編碼區和非編碼區，可以全面地反映遺傳及變異情況，也可以挑選感興趣基因的位點來解釋不同群體或個體對疾病、藥物和環境的差異，從而為遺傳性疾病的研究提供基礎。另外，很多物種SNP是兩種等位基因，即只有兩種堿基組成，只需要通過某種方法檢測出這兩種堿基即可完成基因分型。

隨著SNP發現數目的增加，需要找到一種準確、高通量、低成本的方法對SNP分型并評估對遺傳變異的生物學影響，傳統SangerDNA測序被認為是SNP分型的金標準，但是該方法依賴于gel瓊脂糖電泳，會產生大量的信息，并且耗時，繁瑣【1】。隨后一些非gel依賴的分型方法也被逐漸完善，包括allele特異的雜交，allele特異的引物延伸，allele特異的寡核苷酸連接，allele特異的探針切割等，并通過熒光信號強度、質譜等檢測方法進行SNP分型。

目前基于引物延伸原理的質譜法得到了廣泛的應用，尤其是飛行時間質譜在SNP分型檢測市場上得到了廣泛的應用，較成熟的方法包括：MassExtendassay，iPLEXassay，PinPointassay，GOODassay等【2】，他們有一個共同點，都是通過精確測量延伸產物的分子量，從而判斷樣品中SNP位點的堿基。例如SequenomiPLEXassay基本原理是：先設計特異性引物，經多重PCR擴增含有待測SNP位點的DNA片段，然后針對待測SNP位點設計延伸引物，并在反應體系中加入ddNTP和DNA聚合酶，使得PCR退火時，引物3^/端的堿基剛好與待測SNP位點的堿基互補結合，即引物延伸到多態性位點，鏈延伸終止。通過飛行時間質譜檢測引物及延伸產物兩個峰，兩者的m/Z差值，即為該引物延伸堿基的分子量，從而判斷SNP位點的堿基類型【3】。

但基于引物延伸的質譜檢測方法，在其應用過程中也存在一定的缺陷。

采用了兩步PCR，首先通過PCR將感興趣的區段進行擴增富集SNP位點的拷貝數，然后再進行單堿基延伸反應，為了避免PCR反應剩余的dNTPs和引物影響單堿基延伸的效率，在PCR反應結束后使用蝦堿性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）將PCR產物中的剩余引物和dNTP降解掉，這種方法的缺點是對樣品要求高，純化結果不好，會影響到后續的單堿基延伸反應。

質譜儀的檢測效果與延伸物的分子量緊密相關，分子量越小，區分效果越好。而SequenomiPLEXassay沒有對含SNP位點的寡核苷酸片段進行限制性酶切【2】或用磷酸二酯酶切割（GOODassay），片段較大，使得檢測范圍偏大（4000-9000Da），從而影響了MALDI–TOF分辨率。在延伸引物和產物在高分子量范圍，信號強度也會降低，或許是解吸附效率不高或者檢測元件對于高分子量的分子檢測敏感度下降【4】。

在多重PCR反應中離子競爭和PCR效率的差異也會造成不一致的延伸信號。因此降低背景噪音和優化引物濃度使得因無信號不被延伸信號所遮蓋，是非常感關鍵的。在多重PCR反應中，低分子量引物高信號強度會一定程度上導致高分子量產物弱信號【5】。

基于上述分析，需要開發一種操作簡單、成本低、分辨率高的質譜檢測方法進行SNP分型。

發明內容