[發明專利]基于飛行時間質譜法聯合特異Tags序列進行SNP分型方法的建立(MS-SSTA)

在審

• 申請號: 201410749355.0
• 申請日: 2014-12-10
• 公開（公告）號: CN105734118A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 梁海泳;王姝杰
• 申請（專利權）人: 博淼生物科技（北京）有限公司;王姝杰
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.基于飛行時間質譜法聯合特異Tags序列進行SNP分型的方法包括以下幾個步驟：（1）針對SNP位點，設計3條寡核苷酸探針，第一條和第二條探針的3^/端分別是預先選定SNP位點的兩個等位基因型，即等位基因特異性寡核苷酸探針（allele-specificoligos，ASO），第三條探針與所選定位點的靶序列下游互補，且位于選定SNP位點的下游，即位點特異性寡核苷酸探針（locus-specificoligo，LSO）；（2）對三條寡核苷酸探針進行相應的修飾，然后將經過修飾的多個SNP位點的探針混合，形成探針池；（3）當與目標序列完全匹配時，在TaqDNA連接酶的作用下，經過修飾的等位基因特異性寡核苷酸片段和位點特異性寡核苷酸探針進行連接，得到連接產物；（5）采用通用PCR引物擴增連接產物，其中Tags序列5^/端需要進行生物素修飾，這樣PCR產物中有一條鏈是生物素標記的，便于后續純化；（6）使用限制性內切酶將PCR產物進行酶切，并使用鏈霉親和素包被的beads進行純化；（7）將純化產物移至384孔芯片上，使用飛行時間質譜分析，檢測攜帶特異Tags片段分子量的大小，并根據其分子量的差異來確定樣品中該SNP位點的基因型。

2.權利要求1所述的方法，其特征在于SNP位點的2n條探針ASO探針和n條LSO探針的修飾：ASO探針的上游引入相應的限制性酶切識別序列和特異Tags序列及通用序列；LSO探針的5^/端進行磷酸化修飾，并引入相應的通用序列。

3.權利要求1所述的方法，其特征在于限制性內切酶為稀有位點限制性內切酶，且為回文結構，如DpnI、AluI。

4.權利要求1所述的方法，其特征在于特異Tags序列以及對其5^/端進行生物素修飾。

5.權利要求1所述的方法，其特征在于在進行質譜檢測之前，需要對酶切產物使用鏈霉親和素包被的beads進性純化，一方面減少對質譜檢測結果的干擾，另一方面將帶有生物素修飾的特異Tags片段純化出來，以便進行后續質譜檢測。

6.權利要求1所述的方法，其特征在于純化方法為鏈酶親和素包被的beads純化。

7.權利要求1所述的方法，其特征在于通過飛行時間質譜儀檢測攜帶特異Tags片段的分子量大小。