[發明專利]一種通過引入聚-β-羥基丁酸酯代謝途徑提高鈍齒棒桿菌L-精氨酸產量的方法

在審

• 申請號: 201410748914.6
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104531747A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 饒志明;秦敬儒;徐美娟;張顯;楊套偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/66;C12N1/21;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

通過聚-β--羥基丁酸酯(PHB)代謝途徑引入提高鈍齒棒桿菌(Corynebacterium?crenatum)L-精氨酸產量，本發明屬于基因工程和生物工程領域。具體地說涉及一種PHB操縱子在鈍齒棒桿菌中表達的基因工程菌株的構建及其利用該菌株進行5-L發酵罐高產L-精氨酸的方法。

技術背景

L-精氨酸(L-arginine)是一種含有胍基的堿性氨基酸，在醫藥和食品工業有較廣泛的用途，是人體代謝的一種重要氨基酸，具有獨特的生理和藥理作用，在制藥、保健品及化妝品領域有著廣泛的應用價值，目前國內外對其合成和生產都有著比較深入的研究。近年來微生物發酵法生產L-精氨酸受到越來越多的關注，各國科學家相繼開展這方面的工作。

聚-β--羥基丁酸酯(PHB)是原核微生物在碳、氮營養失衡的情況下，作為碳源和能源貯存而合成的一類熱塑性聚酯。PHB具有良好的生物降解性，可替代傳統的塑料制品制成綠色包裝材料與容器，減少白色污染。再加之PHB的生物相容性以及缺乏免疫反應，使PHB成為一種理想的醫藥材料，可用作手術縫合線、補牙填料、外科的棉繃帶。將PHB代謝途徑引入菌體，調節全細胞代謝網絡，影響C流和能量水平，從而促進相關代謝產物的產量，相關文獻已有報道。

本實驗室保藏有一株鈍齒狀、無芽孢、革蘭式陽性的鈍齒棒桿菌C.crenatum?SYPA，是本實驗室篩選得到的高產精氨酸突變菌株，相關文獻已經報道。本發明所用載體質粒pDXW-10為江南大學王小元教授研究室惠贈，具有tac-M啟動子，在棒桿菌中可中等水平表達外源基因，更利于代謝水平的進行。

本發明通過表達載體pDXW-10，首次實現了在C.crenatum?SYPA中PHB合成關鍵酶β-酮基硫解酶(PhbA)、乙酰乙酰CoA還原酶(PhbB)和PHB合成酶(PhbC)的高效表達。通過5-L發酵罐發酵實驗，實現同一批菌株胞外產L-精氨酸胞內積累PHB的聯產效果，最終實現高效生產L-精氨酸。

發明內容

本發明所使用的原始菌種為C.crenatum?SYPA，該菌株以葡萄糖為碳源，在5-L發酵罐發酵至96h，L-精氨酸產量可達35g/l左右。

本發明的主要研究內容：本發明利用分子技術將來源于Ralstonia?eutropha?H16的聚-β-羥基丁酸(PHB)合成操縱子基因phbCAB從pBHR68質粒上酶切下來，連接到到穿梭表達載體pDXW-10，構建成為重組表達質粒pDXW-10-phbCAB并轉化至文獻已報道的鈍齒棒桿菌C.crenatum?SYPA中，成功構建了基因工程菌株C.crenatum?SYPA/pDXW-10-phbCAB。對構建的基因工程菌株進行酶活力測定及胞內PHB含量測定研究證明C.crenatum?SYPA/pDXW-10-phbCAB中phbCAB得到了表達，實現了同一批菌株胞外產L-精氨酸胞內積累PHB的聯產效果。最終在pH7.0，溫度30℃，轉速600rpm的條件下，C.crenatum?SYPA/pDXW-10-phbCAB以葡萄糖為碳源，5-L發酵罐發酵至96h，L-精氨酸產量可達43.21g/l，提高了L-精氨酸的產量。

本發明的優點和積極效果是：

(1)本發明首次通過在鈍齒棒桿菌中表達PHB合成關鍵酶：β-酮基硫解酶、乙酰乙酰CoA還原酶和PHB合成酶，實現胞內積累PHB和胞外生產L-精氨酸，達到了L-精氨酸和PHB聯產的效果，提高了底物利用效率。

(2)本發明采用5-L發酵罐分批發酵策略，優化發酵條件，最終C.crenatum?SYPA/pDXW-10-phbCAB發酵至96h，L-精氨酸產量達到43.21g/l，PHB在胞內的積累對L-精氨酸產量具有促進效果。

具體實施方式

實施例1：重組鈍齒棒桿菌的構建

質粒pDXW-10-phbCAB構建示意圖如圖1所示，具體過程如下：