[發明專利]一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201410745729.1
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104388594A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 劉湘濤;吳錦艷;田宏;陳妍;尚佑軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 唐瑤

1.一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，包含擴增預混液、陰性對照，其特征在于：還包含陽性對照、序列SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:2的擴增引物和序列SEQ?ID?NO:3的探針引物的混合物。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，其特征在于所述序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:2為：

SEQ?ID?NO.1：上游引物CCCTGGGCGCCTCCTTCGTCA，?

SEQ?ID?NO.2：下游引物TGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGG。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，其特征在于所述探針引物序列為：

SEQ?ID?NO.3：CGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCG。

4.根據權利要求1、2或3所述的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，其特征在于所述序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:2的擴增引物和序列SEQ?ID?NO:3的探針引物濃度均為10pmol/μL，擴增引物及探針引物配比為1:1:1。

5.根據權利要求1或2所述的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，其特征在于所述擴增引物擴增出的條帶序列為：

序列SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:2的由5’端向3’端延長的序列；

SEQ?ID?NO.4（123?bp）：

ccctgggcgcctccttcgtcagcgacgtcacgcagctcgacctgcagcgcgtgcacctgggcgactgcgtcctccgcgaggcctcggaggccatcgacgccatctaccggcggcgctacaaca。

6.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，其特征在于所述陽性對照為構建的pGM-123陽性質粒以及利用其制作的標準曲線，該質粒是擴增引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所擴增的豬偽狂犬病毒基因序列，長度123bp，克隆至pGEM-T?Easy克隆載體，篩選為陽性的命名為pGM-123，即陽性對照，利用陽性對照制作標準曲線。

7.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒組分的配比為：?

a.??2×擴增預混液：25份；

b.?引物濃度均為10pmol/μl的三條引物混合液6份，123bp上游引物2份，123bp下游引物2份，探針引物2份；

c.?無DNA/RNA酶水13份；

d.?陽性對照pGM-123陽性質粒6份；

e.?陰性對照無DNA/RNA酶水6份。

8.一種如權利要求1所述用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟：

a．使用權利要求1所述的檢測試劑盒進行PCR擴增，條件如下：94℃預變性2min；94℃?20s，退火溫度60℃?30s，72℃?20s，40個循環；

b.?結果分析；

根據擴增結果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值<35判為陽性；Ct值介于35～40為可疑，需重復檢測；再次測定時該樣品Ct值<35為陽性，Ct值≥35為陰性。