[發明專利]一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201410745729.1
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104388594A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 劉湘濤;吳錦艷;田宏;陳妍;尚佑軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 唐瑤

技術領域

本發明涉及豬偽狂犬病毒防治技術領域，具體說是一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR（探針法實時-定量聚合酶鏈反應）試劑盒，本發明還包括該試劑盒的使用方法。

背景技術

偽狂犬病病毒（Pseudorabies?virus，PRV）是一種可感染多種家畜和野生動物的皰疹病毒，豬是該病毒貯存宿主和傳染源，該病毒可引起母豬繁殖障礙及初生仔豬大批死亡；成年豬則出現隱性感染，長期帶毒排毒，嚴重影響種豬場生產及優良品種的推廣，給養豬業造成極大的損失。國內對豬偽狂犬病的診斷方法主要包括病毒分離鑒定和血清學診斷方法等，病毒分離鑒定由于費時費力而不適于臨床檢測；由于病毒感染特異性抗體出現較晚，血清學方法也難以用于早期診斷。常規的PCR不僅無法對病料樣本中的病毒進行定量檢測，而且擴增反應后需要電泳檢測，一方面耗時較長，不但不適于大批量樣本的快速檢測，而且容易因操作污染導致假陽性結果；另一方面因核酸電泳時溴化乙錠染色劑的使用對工作人員及環境造成一定的危害。與病毒分離、免疫熒光等傳統方法相比，實時定量PCR方法更加省時，且操作簡單，還可以利用標準曲線計算待檢樣品拷貝數。另外，核酸探針具有特定的序列，只能與具有相應核苷酸堿基互補序列的核酸片段進行結合，也就只能用于樣品中特定基因片段的檢測，因此更加特異。該技術具有敏感性高，特異性強，用時短等優點，而且可以通過熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析，結果更為準確直觀，已成為病原體檢測的重要方法。

本發明通過反復試驗以及引物濃度和探針濃度的優化，制作標準曲線的相關系數R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之間；PCR擴增效率E位于0.9～1.2之間，符合線性關系、擴增效率要求。其快速、靈敏、特異、定性、定量、低污染率等特點均優于普通PCR方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術不能適應快速、敏感和準確及定量的檢測需求，從而提供一種能夠快速、敏感、準確以及定量地檢測病毒的一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，本發明還提供該試劑盒的使用方法。

為解決上述問題，本發明采用了下述技術方案：

一種用于檢測豬偽狂犬病毒的Taqman?Real-time?PCR試劑盒，所述試劑盒包含擴增預混液、陰性對照、陽性對照、序列SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:2的擴增引物和序列SEQ?ID?NO:3的探針引物的混合物。

所述擴增引物序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:2為：

SEQ?ID?NO:1：上游引物CCCTGGGCGCCTCCTTCGTCA，?

SEQ?ID?NO:2：下游引物TGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGG。

所述探針引物序列為：

SEQ?ID?NO:3：CGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCG。

所述擴增引物擴增出的條帶序列為：

SEQ?ID?NO:4（123?bp）：

ccctgggcgcctccttcgtcagcgacgtcacgcagctcgacctgcagcgcgtgcacctgggcgactgcgtcctccgcgaggcctcggaggccatcgacgccatctaccggcggcgctacaaca。

所述陰性對照為無DNA/RNA酶水。

所述陽性對照為含有豬偽狂犬病毒基因序列的陽性質粒pGM-123以及制作的標準曲線；其構建方式如下：

a.?PRV基因組DNA的提取按QIAGEN?DNeasy?Blood&Tissue?Kit（凱杰公司脫氧核糖核酸提取試劑盒）說明書進行操作。以提取PRV滅活疫苗基因組DNA為模板；以SEQ?ID?NO:1及SEQ?ID?NO:2作為引物擴增，反應條件為94℃預變性2min；94℃變性50s,?60℃退火50s,?72℃延伸50s,?共30個循環；72℃再延伸10min,?4℃?5min。PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

b.?PCR產物的克隆及序列分析：

PCR產物用AXYGEN（愛思進）公司的膠回收試劑盒回收，與pGMD-T-Easy克隆載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養基平板上，37℃培養12～16h。經藍白斑篩選后，用AXYGEN質粒提取試劑盒提取質粒，將序列測定為陽性的質粒命名pGM-123。