[發明專利]一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201410745664.0
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104372110A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 劉湘濤;吳錦艷;田宏;陳妍;尚佑軍;王光祥
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 唐瑤

1.一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，包含擴增預混液、陰性對照，其特征在于：還包含有陽性對照、序列SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.2的擴增引物和序列SEQ?ID?NO.3的探針引物的混合物。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述序列SEQ?ID?NO.1至?SEQ?ID?NO.2為：

SEQ?ID?NO.1：上游引物TTAATTGATTGGGCTGATGGTCT，?

SEQ?ID?NO.2：下游引物GCTGCCGGCAATGATGTCTC。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-?PCR試劑盒，其特征在于：所述探針引物序列為：

SEQ?ID?NO.3：GTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGAC。

4.根據權利要求1、2或3所述的一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述序列SEQ?ID?NO.1至?SEQ?ID?NO.2的擴增引物和序列SEQ?ID?NO.3的探針引物濃度均為10pmol/μL，擴增引物及探針引物配比為1:1:1。

5.根據權利要求1或2所述的一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-?PCR試劑盒，其特征在于：所述擴增引物擴增出的條帶序列為：

序列SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.2的由5’端向3’端延長的序列；

SEQ?ID?NO.4（176?bp）：

TTAATTGATTGGGCTGATGGTCTAGAGTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGACCCGCAAGATTTTCCCGCCTTGGAATCTTCCTCCTTTACTCTTCTGGGAGTTAAGAACTTCTTGAATGTCATCACCTTCTAATTTTTCGACTTCTGTTGACCTAGAGACATCATTGCCGGCAGC。

6.根據權利要求1所述的一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述陽性對照為構建的pGM-176陽性質粒以及利用其制作的標準曲線，該質粒是擴增引物SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所擴增的小反芻獸疫病毒基因序列，長度176bp，克隆至pGEM-T?Easy克隆載體，篩選為陽性的命名為pGM-176。

7.根據權利要求1所述的一種用于小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒組分的配比為：?

a.?2×One?Step?RT-PCR?buffer?III：25份；

b.?Ex?Taq?HS：1份；

c.?PrimerScript?RT?Enzyme?Mix?II：1份；

d.引物濃度均為10pmol/μl的三條引物混合液6份，176bp上游引物2份，176bp下游引物2份，探針引物2份；

e.?無RNA酶水11份；

f.?陽性對照pMD-176陽性質粒6份；

g.?陰性對照無RNA酶水6份。

8.一種如權利要求1所述用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒的使用方法，其特征在于：包括以下步驟：

a．使用權利要求1所述的檢測試劑盒進行PCR擴增，條件如下：?94℃預變性2min；94℃?20s，退火溫度54℃?30s，72℃?20s，40個循環；

b.?結果分析；

根據擴增結果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值<35判為陽性；Ct值介于35～40為可疑，需重復檢測；再次測定時該樣品Ct值<35為陽性，Ct值≥35為陰性。