[發明專利]一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201410745664.0
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104372110A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 劉湘濤;吳錦艷;田宏;陳妍;尚佑軍;王光祥
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 唐瑤

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技術領域

本發明涉及小反芻獸疫防治技術領域，具體說是一種用于檢測小反芻獸疫病毒的Taqman?Real-time?RT-PCR（探針法實時-定量聚合酶鏈反應）試劑盒，本發明還包括該試劑盒的使用方法。

背景技術

小反芻獸疫（Peste?des?petits?Ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒(Peste??des?petits?ruminants?virus，PPRV)引起的一種嚴重的傳染病，主要感染小反芻動物，特別是山羊高度易感。該病毒是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbolivirus)的成員，同屬的其他成員還有牛瘟病毒(Rinderpest?virus,

RPV)、犬瘟熱病毒(Canine?distemper?virus，CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise?distemper?virus，PDV)等。PPRV主要侵害淋巴組織及消化道上皮組織，以突然發熱、眼鼻排出分泌物、口腔潰瘍、呼吸失調、咳嗽、惡臭的腹瀉和死亡為特征。本病1942年首次報告發生于西非之象牙海岸，1972年正式確認病原為反芻獸疫，PPRV有4個群，但只有1個血清型。目前已確認發生的國家有象牙海岸、貝寧、多哥、尼日利亞、塞內加爾、加納、馬里、尼日爾、岡比亞、毛里塔尼亞、乍得、蘇丹、沙特阿拉伯、阿曼、約旦、以色列、印度、孟加拉國。近幾年該病在我國的周邊國家頻頻發生，特別是2007年首次在我國西藏發現該病后，2003年年底至今，?PPR在我國新疆、內蒙、甘肅、安徽等地流行非常嚴重，現已嚴重威脅到我國小反芻動物的健康。本病流行猖撅，發病率和死亡率均很高，對山羊生產和畜牧經濟造成嚴重損失。被世界動物衛生組織（OIE）[《國際動物衛生法典》(1999)]動物衛生法典列為必須報告的動物疫病，我國《法定動物疫病病種名錄》中將其列為I類動物疫病。小反芻獸疫嚴重破壞畜牧業生產，造成了動物及其產品的國際貿易障礙，所帶來的巨大經濟損失不可估量。快速準確的診斷是控制和撲滅小反芻獸疫至關重要的一個環節。

常規的病原學診斷方法主要有病毒的分離與鑒定、病毒抗原檢測等，每種診斷方法都有其適用的范圍。用常規病原學方法對血液、淋巴結、脾臟等病毒含量低微的樣品進行檢測，往往得不到正確的結果。分子診斷方法是一種敏感的新技術，RT-PCR技術已廣泛應用于生命科學的各個領域，它具有敏感、特異和操作快速簡便等特點，能使原本診斷十分困難的某些傳染病和遺傳病在分子水平上得到確診。近年來，該方法在PPRV的研究與診斷上已得到了應用，但在檢測PPRV隱性感染和肉品檢疫等方面仍有不足之處。Real-Time?RT-PCR是在常規RT-PCR方法的基礎上，除了常規PCR的擴增以外，還額外增加了一條探針引物，只有在探針引物的有效結合下，才能產生有效擴增，因此檢測的特異性和敏感性大大提高。不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

本發明針對目前的現狀，在長期研究的基礎上，建立并優化出一種簡捷、廉價、敏感的Real-Time?RT-PCR?PPRV檢測方法，并組裝成試劑盒。該方法無需體外單獨進行反轉錄，在同一反應管內就可完成反轉錄和PCR的過程，通過熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析，結果更為準確直觀，且無需電泳觀察結果。大大縮短了時間和減少了污染的機率，保證了我國對PPRV的診斷與國外檢測方法的一致性。該方法具有以下特點：特異性好：與牛瘟、口蹄疫、羊痘、羊口瘡等無交叉反應，假陽性率低于2%；敏感性高：可檢測到100個拷貝數的病毒；穩定性強：在12個月內檢測數據穩定可靠；該方法與國外同類產品相比符合率大于90%。該方法應用的可行性強，對我國小反芻尤其羊免受PPR的威脅，提高農村養羊戶收入，促進國際貿易增長等均具有極其重要的現實意義和社會意義。已成為病原體檢測的重要方法。

本發明通過反復試驗以及引物濃度和探針濃度的優化，（1）制作標準曲線的相關系數R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之間；PCR擴增效率E位于0.9～1.2之間，符合線性關系、擴增效率要求；（2）35Cycles內可得到好的定量結果，符合靈敏度要求；（3）陰性對照35?Cycles內無引物二聚體產生，符合陰性要求。因此，該方法以其快速、靈敏、特異、定性、定量、低污染率等特點優于普通PCR方法。

發明內容