[發(fā)明專利]一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410741458.2
• 申請日: 2014-12-09
• 公開（公告）號: CN104614358A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李雪梅;王琳琳;羅捷
• 申請（專利權(quán)）人: 臨沂大學(xué)
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明為一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，結(jié)合DNA滾環(huán)復(fù)制和核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子拉曼信號探針來實現(xiàn)雙重信號放大。

背景技術(shù)

表面增強拉曼檢測技術(shù)具有制樣過程比較簡單、非入侵和無損等獨特的優(yōu)點。表面增強拉曼檢測手段作為高靈敏的檢測技術(shù)，越來越受到了科學(xué)界的關(guān)注，廣泛應(yīng)用于特定序列DNA、檢測蛋白質(zhì)、體內(nèi)原位檢測、單堿基錯配等生物分析中。由于其光學(xué)透明性，使用二氧化硅殼在表面增強拉曼散射（SERS）為基礎(chǔ)的生物傳感應(yīng)用提供了許多優(yōu)勢，能夠穩(wěn)定存在于環(huán)境介質(zhì)中，并改善生物相容性。

我們報告了一種新的層層組裝法，由二氧化硅、金納米粒子（AuNP）和SERS信號分子組成。金納米粒子因為它們通過粒子結(jié)構(gòu)的針孔的表面電磁場定位能力從單個顆粒強增強效果，這種層層組裝方法的提出，使得硅膠封裝AuNP標簽表現(xiàn)出較強的表面增強拉曼光譜信號以及出色的多路復(fù)用功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：結(jié)合DNA滾環(huán)復(fù)制和核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子拉曼信號探針來實現(xiàn)雙重信號放大檢測凝血酶。在磁珠表面結(jié)合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙鏈DNA探針。在凝血酶存在下，與固定在磁珠表面的雙鏈DNA探針結(jié)合，釋放其中的一條鏈。留在磁珠上的探針作為引物發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，通過檢測拉曼信號實現(xiàn)凝血酶的檢測。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

制備了金納米粒子（AuNP），通過層層組裝的方法將羅丹明異硫氰酸酯封裝在AuNP和SiO2殼之間。由于一個納米粒子可封裝大量的拉曼信號分子，增大了拉曼信號。制備的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子表面修飾兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減少交叉反應(yīng)。

用磁珠作為載體，在磁珠表面結(jié)合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙鏈DNA探針。凝血酶與其適體結(jié)合釋放到溶液中，磁珠表面留下單鏈DNA探針作為引物。加入鎖扣式DNA，在T4?DNA連接酶和Phi?29?DNA聚合酶作用下，留下的DNA鏈發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA。與所制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，從而檢測拉曼信號（附圖1）。

其具體步驟如下：

1)?通過檸檬酸鈉還原HAuCl₄的方法制備了納米金，通過層層組裝的方法將羅丹明異硫氰酸酯封裝在AuNP和SiO2殼之間。再與比例為10:1的DNA鏈結(jié)合形成生物條碼探針。

2）通過羧基與氨基的共價鍵將一端帶有氨基的探針信標固定在羧基功能化的磁性納米顆粒上，再與凝血酶適體雜交，獲得識別探針。

3）將目標凝血酶分子與識別探針混合，在磁珠表面進行雜交后，釋放其中的一條鏈。留在磁珠上的探針作為引物發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針。

4）在外加磁場的作用下將多余的信號納米粒子探針清洗干凈，檢測拉曼信號。利用凝血酶的標準溶液獲得檢測的工作曲線，?從工作曲線進行凝血酶實際樣品的分析。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點：

本發(fā)明用制備的核殼結(jié)構(gòu)納米探針包含大量拉曼信號分子，結(jié)合DNA滾環(huán)復(fù)制形成利用雙重信號放大，通過拉曼光譜檢測，建立了一種高靈敏的拉曼光譜檢測凝血酶的方法。相對于現(xiàn)有的檢測方法，有以下特點：

(1)通過表面增強拉曼光譜檢測，操作簡單，靈敏度高。

(2)設(shè)計了一種核殼結(jié)構(gòu)納米探針，包含大量拉曼信號分子，可通過金增強作用進行拉曼信號放大。制備的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子表面修飾兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減少交叉反應(yīng)。

(3)DNA滾環(huán)復(fù)制可形成具有重復(fù)堿基序列的DNA長鏈，一個靶分子可以結(jié)合大量納米粒子探針。

(4)雙重信號放大提高了檢測靈敏度。

四、附圖說明

圖1.拉曼光譜檢測凝血酶方法的示意圖

五、具體實施方式

實施例1：?核-殼結(jié)構(gòu)的拉曼信號標記納米粒子制備