[發明專利]基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統的應用

有效

• 申請號: 201410737627.5
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN104450617A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 藍田;J·蓋茨;鄭敦武
• 申請（專利權）人: 賽業（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0783
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 馬偉

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體地說，涉及一種基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統的應用。

背景技術

現有的細胞分選技術主要有以下兩種：

①流式細胞分離技術

通過分離含有單細胞的液滴而實現的。將待測細胞與單克隆抗體和熒光染料結合后制成懸浮標本，在一定氣體壓力下樣品進入流動室，在不含細胞的緩沖液包裹下單行排列。在流動室的超高頻的壓電晶體的高頻振蕩下，液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷，當帶電液滴通過電場，在電場的作用下發生偏轉，然后落入相應的收集器之中，從而實現細胞分選。

②免疫磁珠技術

磁珠表面包被具免疫反應性的抗體，與細胞表面的抗原進行特異性結合；后者置于強大的磁場下，就會與未結合的細胞分開；脫離磁場后會立即消失磁性，這樣就可以篩選或去除所標記的細胞，從而達到篩選出陽性或陰性細胞的目的。其流程圖如圖1所示。

以上技術存在以下不足：流式細胞分離技術雖然可以分選得到目的細胞，但是①細胞必須能被熒光分子標記；②只能檢測懸浮的單細胞；③分選過程不夠溫和，對細胞傷害大；④可能污染細胞；⑤不利于大體積樣品的分選。免疫磁珠分選技術雖然可以通過正、負兩種篩選獲得目的細胞，但是①無法完成“一次結合”分離多種細胞；②如果需要從一個樣品里面篩選多個目的細胞，需要多次結合和洗脫，得到的細胞活性差、得率低；③多次分選，成本高；④目的細胞與磁珠不能完全分離，不利于后續研究。

目前關于對細胞傷害小、可同時分選多種細胞、獲得的目的細胞能夠與載體徹底分離，適用于大量及脆弱細胞分選的技術還未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統的應用。

本發明的再一的目的是，提供分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒的應用。

為實現上述第一個目的，本發明采取的技術方案是：

基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統在分選細胞中的應用，所述的分選系統包含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質、限制性內切酶；所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補，且互補區域含有所述限制性內切酶的識別位點；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質均被修飾，修飾后的第一單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細胞分選介質相連接。

優選地，所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸為部分序列互補或完全互補。

優選地，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為6bp-1kb。

更優選地，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為18bp-50bp。

優選地，所述的細胞分選介質是磁珠、分離柱或聚陽離子納米顆粒。

更優選地，所述的第一單鏈核苷酸被巰基修飾，所述的第二單鏈核苷酸被生物素修飾，所述的抗體被順丁烯二酰亞胺修飾，所述的磁珠被鏈霉親和素修飾。

為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：

分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒在分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞中的應用，所述的試劑盒包含以下組分：巰基與生物素修飾的三對單鏈核苷酸，CD3、CD56和HLA-DR抗體，鏈霉親和素磁珠，限制性內切酶BamH?I、EcoR?I、Hind?III。

所述的三對單鏈核苷酸的互補區域分別包含限制性內切酶BamH?I、EcoR?I、Hind?III的識別位點。

優選地，所述的三對單鏈核苷酸的序列分別如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.6所示。

本發明還涉及一種從細胞樣品中分選目的細胞的方法，所述的方法包括以下步驟：

a)合成互補的單鏈核苷酸，制備“磁珠/單鏈核苷酸”和“抗體/單鏈核苷酸”復合物；

b)在細胞樣品中加入“抗體/單鏈核苷酸”復合物，形成“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物；

c)將“磁珠/單鏈核苷酸”復合物加入到“單鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物中，形成“磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細胞”復合物；

d)通過外加磁場的作用，磁性吸附目的細胞，去除非目的細胞；

e)針對不同的目的細胞，每次使用不同的限制性內切酶剪切含有特定識別序列的雙鏈核苷酸，逐次洗脫不同的目的細胞。