[發(fā)明專利]一種水體游離基因污染物的濃集回收方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410737432.0
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號(hào): CN104498596A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金敏;李君文;王大寧;邱志剛;諶志強(qiáng);楊棟;劉璐;郭旋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水體游離基因污染物的濃集方法。

背景技術(shù)

核酸，作為生命物質(zhì)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，在生物死亡后，有可能會(huì)釋放到環(huán)境中并持久性殘留。如果該生命為耐藥細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因生物，不論其耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分是直接排入水環(huán)境中，還是經(jīng)土壤或空氣等其它途徑傳播，在地表徑流或大氣沉降作用下，這些游離的耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分會(huì)最終被遷移到河流、湖泊、水庫等水環(huán)境中。因此，水環(huán)境是大氣、土壤、食品等其他介質(zhì)中耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分的“匯”，即水體是耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分的儲(chǔ)存庫。

傳統(tǒng)認(rèn)為，耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分只能在特定條件下才能水平轉(zhuǎn)移到受體細(xì)菌體內(nèi)，使該細(xì)菌獲得耐藥性或轉(zhuǎn)基因成分。然而，近幾年來，越來越多的報(bào)道顯示，耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移和傳播具有一定特殊性，水質(zhì)因素、特殊(微)環(huán)境、特殊物質(zhì)均可能在一定條件下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生，使耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分轉(zhuǎn)移傳播給其它微生物，而導(dǎo)致耐藥性或轉(zhuǎn)基因成分轉(zhuǎn)移和傳播。例如，生物膜，作為一種廣泛存在的特殊水體微環(huán)境，其相對的空間穩(wěn)定及細(xì)菌的緊密接觸促進(jìn)了細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移的發(fā)生；納米顆粒，已經(jīng)被報(bào)道不僅顯著促進(jìn)水中耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移，而且還可顯著促進(jìn)耐藥基因的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)；另外，美國環(huán)境醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院已經(jīng)確定，轉(zhuǎn)基因成分可以在一定條件下轉(zhuǎn)移到腸道微生物的核酸組成中；陳建等也發(fā)現(xiàn)，海河、珠江等地表水均存在一定程度的人工質(zhì)粒來源耐藥基因(轉(zhuǎn)基因成分)污染。因此，游離耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分等基因污染物不僅已經(jīng)成為國內(nèi)外公認(rèn)的新型環(huán)境污染物，而且其污染已成為重大公共衛(wèi)生與生態(tài)安全問題。

然而，一般情況下，水環(huán)境中游離耐藥基因或轉(zhuǎn)基因成分等基因污染物含量非常少，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有檢測方法如PCR、熒光定量PCR的檢測靈敏度。因此，若想有效地檢測飲用水、地表水、回用水等各種水體中的基因污染物，首先必須對一定水樣進(jìn)行濃集處理，從不同水體中將少量的基因污染物濃集、回收出來，以供實(shí)驗(yàn)室和/或現(xiàn)場檢測用。

目前，水中核酸(包括質(zhì)粒)的濃集，主要采用沉淀法和吸附洗脫法。其中，沉淀法利用等體積乙醇、異丙醇等有機(jī)試劑，將水樣中游離核酸或質(zhì)粒沉淀出來，再通過離心而將核酸或質(zhì)粒濃集；吸附洗脫法則利用硅膠柱，將水中的游離核酸或質(zhì)粒吸附在硅膠材料表面,然后再利用洗脫液將其洗脫回收。這些方法雖快速、靈敏，但僅適于小體積，一般為幾毫升(吸附洗脫法)到幾十毫升(有機(jī)試劑沉淀法)的水樣，而對于100毫升以上的大體積水樣，這些方法均不適用，不僅消耗大量有機(jī)試劑，而且回收效率易受水質(zhì)影響。目前，國內(nèi)外均沒有適于大體積水，尤其自來水、飲用水、地表水、回用水等各種水體中核酸，尤其游離基因污染物的濃集技術(shù)或方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從大體積的水體游離基因污染物的濃集回收方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種水體游離基因污染物的濃集回收方法，包括如下步驟：

(1)核酸吸附顆粒的制備：按比例，將12.6g的氯化鋁緩慢加入至2L去離子水中，充分溶解后，加入2mol/L的碳酸鈉水溶液90ml，混勻，調(diào)節(jié)pH＝7.2，形成凝膠；靜置6～12h，除去上清，用0.14mol/L的NaCl水溶液洗滌凝膠2次后，再加入0.14mol/L的NaCl水溶液至2L，得到含水氫氧化鋁凝膠，滅菌；將粒度在60～100目的層析用硅膠，經(jīng)過蒸餾水淘洗除去漂在水面上的顆粒后，滅菌，按每300g滅菌后層析用硅膠加入0.5-1L含水氫氧化鋁凝膠的比例，使滅菌后層析用硅膠浸透混勻，烤干，得到核酸吸附顆粒；

(2)洗脫液的配制：將15g氯化鈉、30g胰蛋白胨、15g牛肉粉和3.75g甘氨酸加水至1L，用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至9；

(3)將所述載核酸吸附顆粒裝入長與直徑比為5-35的過濾柱中并至過濾柱高度的2/3處；將待測水樣以300-50毫升/分鐘的速度勻速流過過濾柱后，再用洗脫液以40-50毫升/分鐘的速度勻速流過過濾柱，用滅菌容器收集流出的洗脫液，即為游離基因污染物的一次濃集液；在無菌條件下，利用注射器將一次濃集液通過孔徑為0.45微米的無菌濾器以除去細(xì)菌；除菌后的濾過液加入等體積無水乙醇或異丙醇并靜置0.5-2小時(shí)后，離心收集沉淀；用2.5-50毫升的無菌雙蒸水溶解沉淀，即為游離基因污染物的最終濃集液；所述待測水樣與洗脫液的體積比為100：1-5。

待測水樣的水源為自來水、純凈水、井水、回用水、二級出水、地表水或生活污水。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是

1.操作簡便，不需要任何儀器設(shè)備；