[發明專利]磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的制備及其產品和應用

在審

• 申請號: 201410736026.2
• 申請日: 2014-12-04
• 公開（公告）號: CN104480101A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 李平;馮駿晨;莫婷
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12P41/00;C12P13/04
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

技術領域

本發明屬于納米材料制備技術和生物催化技術領域，尤其是涉及一種磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的制備方法及其產品和應用。

背景技術

茶氨酸是一種非蛋白質氨基酸，屬酰胺類小分子化合物，僅被發現存在于山茶科植物和一種蕈體內，是具有生物活性的次生代謝產物。研究表明，茶氨酸能夠作為一種安全可靠的食品和保健品添加劑用以改善風味，降低血壓，幫助緩解焦慮情緒并促進學習和記憶，保護神經系統及抗氧化等作用。

茶氨酸存在L型和D型兩種對映體，自然界天然存在的茶氨酸多為L型。高效拆分茶氨酸對映體，是深入探討L型和D型茶氨酸對人類健康影響的關鍵。在眾多的氨基酸拆分技術中，由于酶法具有拆分效率高、立體選擇性高、反應條件溫和、專一性強、操作簡單和有利于環保等優點，使得它在工業生產中具有很好的應用前景。氨基酰化酶法是同時得到兩種構型氨基酸的最佳拆分方法，在日本已實現工業化生產。

氨基酰化酶(EC?3.5.1.14；aminoacylase)，也稱N-酰基-L-氨基酸酰胺水解酶(N-acyl-L-amino-acid?aminohydrolase)，它是生物技術領域應用最廣泛的十種酶之一。該酶具有較強光學特異性，它將L-氨基酸酰化物水解成L-氨基酸，而未被水解的D-氨基酸酰化物和L-氨基酸分離后，經過一步水解就可以得到D-氨基酸，從而將L-氨基酸和D-氨基酸分離開來。由于使用游離酶拆分氨基酸時，酶的利用率低，生產成本較高，也不利于產品的分離純化。因此，通過固定化酶拆分氨基酸是工業應用的趨勢。

納米磁性材料因具有超順磁性、量子尺寸效應，表觀磁性等一系列特殊性質，近年來成為研究熱點。根據不同需要，納米顆粒表面經過修飾后可以帶上-NH₂、-COOH、-CHO等活性基團，這些基團又可以再連接抗體、生物酶、蛋白等具有生物活性的大分子物質。在生物醫學方面，納米磁性材料可用于靶向藥物、核磁共振成像、磁熱療等，具有廣闊的應用前景。

在眾多磁性納米材料中，Fe₃O₄磁性納米顆粒備受關注，它是反尖晶石結構鐵氧體，具有制備工藝簡單、無毒、性質穩定、生物相容性好等優點。磁性四氧化三鐵納米顆粒具有良好的表面活性和吸附性能，更具有超順磁性，方便固定化酶在外加磁場的作用下快速回收，避免離心、篩板等耗能步驟。制備Fe₃O₄磁性納米顆粒的常用方法有共沉淀法、溶膠凝膠法、微乳液法、水熱法(溶劑熱法)、模板合成法。

中國專利CN?101671664?A公布了一種固定化氨基酰化酶的制備方法，其包含下列步驟：在水中，60-90℃下將固定化材料(卡拉膠和明膠)溶解，降溫至40-60℃，再加入氨基酰化酶，混合均勻，然后將此混合液流加到溫度為20-35℃的有機溶劑中，攪拌，過濾得顆粒，將所得顆粒加入到KCL水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCL水溶液中還含有戊二醛。該專利還公開了由其制得的固定化氨基酰化酶及其應用。其制備方法可有效降低固定化材料的凝固點，并且制得的固定化氨基酰化酶是顆粒狀，流動性好，可以高效方便的拆分光學活性氨基酸。上述專利專注于酶的固定化，產品為固體顆粒，且需要過濾回收的固體顆粒，步驟繁瑣。上述專利的產物的最適反應溫度為37℃。但是在工業發酵生產過程中，發酵罐內溫度很難達到37℃這樣的低溫，或者需要價格高昂的冷卻設備才能達到，所以，上述專利的實用性較差。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的制備方法及其產品和應用。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明第一方面提供一種磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備四氧化三鐵納米顆粒；

(2)將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散后，在氮氣保護下，與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應，制備氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒；

(3)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒與氨基酰化酶溶液混合反應，得到磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶。

步驟(1)中制備四氧化三鐵納米顆粒的方法通過化學共沉淀法完成，優選以下條件能夠制備出磁性強、性質穩定的磁性四氧化三鐵納米顆粒：