[發明專利]一種劍葉龍血樹愈傷組織誘導及防褐化的方法

有效

• 申請號: 201410735185.0
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN104472362A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 韋瑩;韋坤華;李翠;李林軒;王一諾;黃雪彥;繆劍華;王曉峰
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區藥用植物園
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明涉及一種植物愈傷組織誘導及防褐化方法，特別是一種劍葉龍血樹的愈傷組織誘導及防褐化方法。

背景技術

劍葉龍血樹(Dracaena?cochinchinensis(Lour)S.C.Chen)又名千年木、血竭樹、交趾龍血樹，是漸危種，屬國家二級保護植物，主要分布于廣西、云南、海南等地。劍葉龍血樹具有很高的藥用價值，從其樹脂提取的血竭被稱為麒麟竭，為我國傳統名貴中藥材，在我國已有1500年以上的使用歷史。此外，其造型古樸典雅，具有很高的觀賞價值。2003年被國際自然與自然資源保護聯合會劃歸為易受危害的物種列為紅色名單，被定為佛得角紅皮書中的瀕危物種，是目前國內公認的國產龍血竭的基源植物。

據《本草綱目》記載，龍血竭性溫、平，味甘、咸，無毒，入血分，歸肺、脾、腎三經，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅散結，生肌斂瘡等顯著功效，有“活血圣藥”的美譽。現代醫學研究證實，血竭具有改善機體微循環、調整機體新陳代謝、改善機體免疫功能等作用。隨著血竭在醫學臨床中應用范圍的拓展，血竭有供不應求的趨勢。再加上龍血樹的生長非常緩慢，一年之內樹干增粗還不到1厘米，龍血竭又為龍血樹受傷后流出的紅色液體，產量非常有限，目前價格已漲到1000～1300元/kg，致使人們對劍葉龍血樹野生資源實施了不合理的掠奪性采伐，其野生資源日趨枯竭，瀕危滅絕。也由此出現了多種龍血竭的混偽品在全國各地市場上廣泛流通，引發了惡性循環的市場現象和多起中毒事故。藥材劍葉龍血樹也由于受到氣候、產地等各種因素的影響，藥材質量會有較顯著的差異。

劍葉龍血樹在組培快繁技術上取得了初步進展，但在外植體增殖、誘導初分化及再分化過程中，自身組織會向培養基釋放褐色物質導致培養基逐漸變褐，從而嚴重影響愈傷組織和無菌苗的質量甚至死亡，嚴重限制劍葉龍血樹愈傷組織培養效率，難以滿足大規模生產的需要。為此，探索劍葉龍血樹愈傷組織誘導的最佳激素因子和條件，并通過添加防褐化物質、改變培養環境等方式找到更佳的抑制褐化辦法，以期有效降低褐化率，建立高質量的劍葉龍血樹愈傷組織培養體系。

發明內容

本發明的目的是提供一種劍葉龍血樹的愈傷組織誘導及防褐化的方法，它能夠短時間產生大量的長勢良好的愈傷組織、為市場提供優質“血竭”原材料。

本發明通過以下技術方案達到上述目的：一種劍葉龍血樹的愈傷組織誘導及防褐化的方法，包括以下步驟：

(1)外植體的消毒：取劍葉龍血樹種子作為外植體，先用洗潔精水溶液清洗種子表面污垢，置于燒杯中進行流水沖洗5～8min，然后移至超凈工作臺上，用75％酒精將種子浸泡30S，無菌水沖洗1遍，再用添加了1-2滴吐溫-20的100ml濃度為0.1％HgC1₂消毒8～15min，無菌水浸泡3次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；

(2)種子誘導：將步驟(1)得到的外植體接種到MS誘導培養基中，在培養溫度為25±2℃，光照強度20～30μmol/(m²·s)，光照時間為12h/d的條件下培養15d，種子發芽，所述種子誘導MS誘導培養基為MS基本培養基中加入0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖，4.5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8；

(3)芽誘導獲得愈傷組織：將步驟(2)中得到的無菌芽置于MS誘導培養基中，在培養溫度25±2℃，光照強度20～30μmol/(m²·s)，光照時間為10h/d的條件下培養7d開始萌發，15d便形成愈傷組織，所述芽誘導MS誘導培養基為MS基本培養基中加入0.1～2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.05～0.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1～1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，4.5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8；

(4)愈傷組織增殖培養：將步驟(3)中得到的愈傷組織置于MS增殖培養基中，培養溫度25±2℃，光照強度20～30μmol/(m²·s)，MS增殖培養基為MS基本培養基中加入0.1～1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5～2.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1～0.5mg/L的激動素KT,30g/L蔗糖，4.5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8；