[發明專利]一種攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的制備方法

在審

• 申請號: 201410734897.0
• 申請日: 2014-12-04
• 公開（公告）號: CN104524598A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 程文;吳博林
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/48;A61K49/22;A61P35/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種納米微泡的制備方法，具體涉及一種攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的制備方法，屬于生物醫學工程領域。

背景技術

肝癌是威脅人類健康的一大殺手，被稱為“癌中之王”。發病率呈逐年上升趨勢，據統計，每年全球肝癌發病率位居惡性腫瘤發病率的第五位，死亡率位居第三位，新患肝癌患者中55％發生在中國。手術切除是其治療的主要方法。然而，肝癌細胞生長迅速較早發生血液轉移，因此大多數患者失去了手術的機會。傳統的放、化療對其治療效果也并不理想。肝臟因其再生能力強、合成多種蛋白質等特點，已成為基因治療的理想靶器官。

以往研究顯示，NET-1基因屬于四次跨膜蛋白(TM4S)家族成員，在細胞信號轉導、調節、黏附、移動、增殖和分化中起重要作用，具有顯著上調癌形成的作用。RNA干擾技術，是指由與靶基因序列同源的短的雙鏈RNA(siRNA)引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程。siRNA是一種小RNA分子(21～25核苷酸)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成。雙鏈RNA經酶切后會形成很多小片段，稱為siRNA。siRNA只降解與其序列互補配對的mRNA。其調控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達，所以是一種典型的負調控機制。

超聲微泡既可以作為超聲顯像的造影劑，又可以作為藥物或基因的載體，實現藥物和基因的靶向遞送，是一種無創性、具有組織和器官特異性的藥物運載工具。超聲靶向照射特定區域內的微泡，可使之破壞、爆破，釋放其攜帶的藥物或基因，使局部藥物或基因含量增多。

腫瘤血管由兩部分組成，一部分是宿主固有的血管，在腫瘤生長的過程中，宿主局部的微血管大部分被破壞，僅有動脈和較大的靜脈可能保留下來，成為腫瘤血管系統的主干，該部分血管通透性正常，其管壁的最大孔徑不超過100nm；另一部分是腫瘤新生血管，其結構不完善，基底膜不完整，管壁薄且缺乏平滑肌層，通透性明顯升高，其管壁的最大孔徑約380～780nm，有時血管外的腫瘤細胞可直接與血管管腔相連。納米級微泡可以有效的通過孔徑約380～780nm的血管壁進入腫瘤組織內部，更加高效的轉運NET-1siRNA。

本發明擬導入NET-1siRNA，沉默NET-1的表達，從根本上抑制肝癌細胞的增長，起到治療肝癌的作用。以何種方式導入NET-1siRNA是其能否高效發揮作用的首要前提，也是肝癌基因治療的核心問題。本發明發明人前期研究發現低頻超聲聯合微泡轉染NET-1siRNA能夠有效抑制肝癌細胞的生長，但基因轉染效率有限。據此提出假設，應用超聲聯合靶向載NET-1siRNA納米微泡治療肝癌，將G-PLL作為靶向配體制備靶向納米微泡，并將NET-1siRNA與其偶聯，構成僅有納米級大小的載基因復合物。該復合物在超聲波的照射下經過血管壁進入腫瘤細胞內，有效地解決siRNA在體內易降解、難以進入靶細胞這一難題。

本發明發明人設想構建納米級微泡造影劑作為NET-1siRNA的載體，這樣既可以使治療基因穿過血管內皮間隙進入腫瘤組織內部，同時在超聲波的輻照下，利用空化效應和聲孔效應進一步提高腫瘤組織局部基因含量，提高基因轉染效率，保護siRNA免受血液循環中核酸酶的降解，提高治療效果，此外這種納米微泡還可以進行成像，使得納米微泡既可以作為治療基因的載體又可以作為超聲成像的造影劑，具有雙重作用。

但一般納米微泡對腫瘤組織的特異性較差，不能保證靶部位較高的siRNA濃度，提高基因治療的靶向性。目前，關于靶向造影劑的制備方法包括兩種，一種是通過靶向配體與載體的靜電吸附能力制備。另一種是以偶聯“生物素(Biotin)-親和素(Avidin)”的方法制備。該納米微泡表面通過氨基聚乙二醇偶聯生物素，再與親和素修飾的生物素化靶向分子特異性結合，構成靶向納米微泡。本發明利用半乳糖基化多聚賴氨酸(G-PLL)能與肝癌細胞的ASGP-R特異性結合的特性，制備肝癌細胞特異靶向性納米微泡。

發明內容

本發明的目的在于提供一種攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的制備方法以及由該制備方法制備得到的攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡。

為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案：

一種攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：