[發(fā)明專利]一種攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410734897.0
• 申請(qǐng)日: 2014-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN104524598A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程文;吳博林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K47/48;A61K49/22;A61P35/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

1.一種攜NET-1?siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)合成3對(duì)NET-1?siRNA序列，并使之生物素化：3對(duì)NET-1?siRNA序列分別為SEQ?ID?NO:1-SEQ?ID?NO:6所示，且均經(jīng)FAM熒光和生物素標(biāo)記，得到生物素化NET-1?siRNA，凍干分裝，-20℃保存；

(2)制備生物素化納米微泡：將DSPC、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-biotin溶解于氯仿與甲醇混合溶液中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入PBS緩沖液，移液到離心管中，并將離心管內(nèi)的空氣置換為惰性氣體，震蕩，超聲破碎，靜置，浮集上層微球即所制生物素化納米微泡；

(3)合成生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸：在弱堿性溶液中，在硼氫化鈉作用下，通過還原氨化法進(jìn)行半乳糖與多聚賴氨酸共價(jià)連接，化學(xué)合成半乳糖基化的人工配體G-PLL，利用透析袋對(duì)G-PLL反應(yīng)液進(jìn)行透析，并用Molish反應(yīng)檢測(cè)透析液中未反應(yīng)的乳糖，透析至Molish反應(yīng)陰性，透析結(jié)束，透析液于干燥箱內(nèi)干燥至白色結(jié)晶析出，得純化的配體G-PLL，將G-PLL與BNHS混勻后室溫反應(yīng)2小時(shí)，透析即得生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸；

(4)通過生物素-親和素系統(tǒng)將上述步驟的生物素化NET-1?siRNA、生物素化納米微泡和生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸偶聯(lián)，即得攜NET-1?siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述DSPC、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-biotin的質(zhì)量比為9:0.5:0.5；所述氯仿與甲醇的體積比為2:1；所述蒸干為真空狀態(tài)下40℃蒸干；所述PBS緩沖液的pH值為7.4，濃度為0.15mol/L；所述惰性氣體為C₃F₈；所述震蕩的時(shí)間為40s；所述超聲破碎的條件為：于55℃下水浴20s，停止破碎，同樣溫度孵育60min，之后繼續(xù)破碎2min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述多聚賴氨酸、半乳糖和硼氫化鈉的質(zhì)量比為1.29:5.36:3.35；所述還原氨化法的反應(yīng)條件：37℃恒溫反應(yīng)24小時(shí)后，將反應(yīng)液調(diào)至pH8.5，37℃繼續(xù)反應(yīng)6小時(shí)；所述干燥為70℃恒溫干燥；所述G-PLL和BNHS混合時(shí)的摩爾比為BNHS：G-PLL>20。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述制備攜NET-1siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡的具體步驟為：

①吸取制備好的生物素化納米微泡，加入過量的鏈酶親和素，輕微吹打使其混勻，37℃下反應(yīng)30min，制成溶液1；

②將生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸用無菌雙蒸水調(diào)整至濃度1mg/mL后，逐滴加入溶液1中，直至生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸溶液過量；輕微吹打使其混勻，37℃下反應(yīng)30min；離心，吸取下層清液，洗去未結(jié)合的生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸；

③然后在步驟②所制備的微泡液中加入過量生物素化NET-1?siRNA，4℃靜置30min；

④再用PBS沖洗兩遍，洗去未結(jié)合的NET-1?siRNA，形成攜載NET-1siRNA和生物素化半乳糖基化多聚賴氨酸的納米微泡。

5.按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的攜NET-1?siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡。

6.權(quán)利要求5所述的攜NET-1?siRNA的雙功能肝癌靶向納米微泡在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。