[發明專利]一種DC細胞與CIK細胞的共培養方法

在審

• 申請號: 201410733771.1
• 申請日: 2014-12-06
• 公開（公告）號: CN104450616A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 閆敬武;杜成德;程思博;孟艷芬
• 申請（專利權）人: 山東世博金都藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0783
• 代理公司: 淄博佳和專利代理事務所 37223
• 代理人: 張雯

1.DC細胞與CIK細胞的共培養方法，其特征在于，由如下步驟組成：?1）提取單個核細胞、2）CIK細胞培養、3）DC細胞培養、4）DC細胞和CIK細胞混合培養、5）擴增培養；

其中，步驟4）DC細胞和CIK細胞混合培養具體操作如下：

4.1）將培養瓶中的DC培養基混勻后，轉移至無菌離心管；然后向培養瓶中加入10ml經4?℃預冷的生理鹽水，晃動培養瓶，并用10ml?移液管吹打瓶底的細胞，完畢后將培養瓶內液體移至無菌離心管，最終在離心管中得到用生理鹽水懸浮的DC細胞，即DC細胞懸液；

4.2）將收集好的DC細胞懸液在離心機內，室溫條件下離心10~20分鐘；離心，棄上清液，繼續用生理鹽水重懸細胞，獲得一次重懸細胞液，并對一次重懸細胞液進行取樣計數；

4.3）從層流室的4℃冰箱中取出培養基，靜置待培養基恢復至37℃；將步驟4.2）重懸細胞液進行離心，離心后棄上清液，用10ml??培養基重懸細胞，獲得二次重懸細胞液，并對二次重懸細胞液進行取樣計數；

4.4）吸取1.0×106個DC細胞、1.0×108個CIK細胞，在添加有培養基的培養體系中混合培養，培養體系為50ml?；按照50?~100ng/ml的濃度向培養體系中補加2500?ng~5000ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、體積分數5~6%?的CO₂培養箱繼續培養；培養12小時后，再次添加2500?ng~5000ng的因子GM-CSF，置于37℃、體積分數5~6%?的CO₂培養箱繼續培養。

2.根據權利要求1所述的DC細胞與CIK細胞的共培養方法，其特征在于：所述步驟1）提取細胞采用如下操作：

1.1）轉移外周血：采集患者50~80ml?外周血，并轉移到無菌離心管中，平均每管20~40ml??；

1.2）鋪層加樣：將血樣與生理鹽水按1：1的體積比混合均勻，并緩慢加入盛有室溫的5~20ml?人淋巴細胞分離液的無菌離心管中，配平后進行離心；?

1.3）提取單個核細胞：離心完畢后，離心管內出現分層，吸取血漿生理鹽水層棄之，直至距白膜層5毫米處；將紅細胞層之上的所有液體轉移至無菌離心管中，按細胞懸液與生理鹽水體積比為1：1向無菌離心管中補充生理鹽水，混勻；

1.4）洗滌Ⅰ：將步驟1.3）無菌離心管中所得的細胞進行離心，棄上清液，用生理鹽水重懸細胞，混勻；

1.5）洗滌Ⅱ：將所得細胞收集到一支離心管中，加生理鹽水至50ml?，充分混勻，離心，棄上清液；

1.6）洗滌Ⅲ：將所得細胞收集到一支離心管中，補生理鹽水至40ml?，充分混勻，取樣計數，離心，棄上清液，即得提取獲得外周血單個核細胞。

3.根據權利要求1所述的DC細胞與CIK細胞的共培養方法，其特征在于：所述步驟2）CIK細胞培養具體操作如下：

2.1）接種細胞：使用培養基，將外周血單個核細胞的密度調整到4.0×10⁶～6.0×10⁶個/ml，接種至培養瓶中，置于37℃、體積分數5~6%?的CO₂培養箱繼續培養1~2小時；

2.2）單核細胞分離：取出培養瓶，搖晃多次使沉降于底部的懸浮細胞浮起，將培養基轉至無菌離心管中，再緩慢往瓶中加入10ml?培養基，晃動洗滌多次，并收集殘留非貼壁細胞于無菌離心管中；

2.3）向步驟2.2）培養瓶中加入25~30ml??培養基，補充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，體積分數5%?的CO₂培養箱繼續培養，所得細胞為DC前體細胞；

2.4）將收集到的DC前體細胞取樣計數，用培養基調整細胞密度至1.0～2.0×10⁶/ml?接種到培養瓶中，加入因子IFN-γ混勻，置于37℃、體積分數5~6%?的CO₂培養箱繼續培養；

2.5）上述懸浮細胞在經過24小時的培養后，向培養瓶中加入因子IL-2、IL-1α、抗CD3單抗，此后所培養的細胞即為CIK細胞。