[發明專利]一種DC細胞與CIK細胞的共培養方法

在審

• 申請號: 201410733771.1
• 申請日: 2014-12-06
• 公開（公告）號: CN104450616A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 閆敬武;杜成德;程思博;孟艷芬
• 申請（專利權）人: 山東世博金都藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0783
• 代理公司: 淄博佳和專利代理事務所 37223
• 代理人: 張雯

技術領域

一種DC細胞與CIK細胞的共培養方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術

CIK生物免疫治療作為21世紀治療腫瘤的首選方案，廣泛用于各種實體瘤的治療。CIK生物免疫治療具備：1）增殖，可以在短時間內大量擴增；2）CIK細胞來源于自身對人體沒有任何毒副作用；3）殺瘤譜廣，對絕大多數腫瘤都具備殺傷效力；4）殺瘤活性高，且不受CSA、FK506等免疫抑制劑的影響；5）可有效抵抗腫瘤細胞引發的凋亡機制。樹突狀細胞,簡稱DC細胞,?是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，增殖細胞毒性T淋巴細胞CTL，從而介導強大的特異性抗腫瘤細胞免疫。

DC細胞是機體免疫應答的始動者，能夠誘導持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應；CIK細胞可通過非特異性免疫殺傷作用清除腫瘤患者體內微小殘余病灶，所以負載腫瘤抗原的DC與CIK的有機結合,即DC-CIK細胞,能產生特異性和非特異性的雙重抗腫瘤效應。DC細胞與CIK細胞共培養后，提高了細胞的增殖速度和殺傷活性，且使其對腫瘤細胞的殺傷作用更具特異性。然而，現有的DC-CIK共培養，是將收獲的DC細胞添加到CIK培養體系中，從而通過DC細胞與CIK細胞的結合，將DC細胞攜帶的抗原信息提成給CIK細胞；但是CIK的培養環境不利于DC細胞的生長，不能有效的長時間維持DC細胞的活性，從而影響DC細胞提呈抗原的效率。DC細胞成熟慢、生存期短，CIK細胞的擴增培養時間較長，兩種細胞共培養后存在培養時間不同步的問題，導致所獲的DC-CIK細胞活性降低。目前迫切需要一種可延長DC細胞生存期的DC-CIK共培養方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：克服現有技術的不足，提供一種DC細胞與CIK細胞的共培養方法，該方法可明顯延長DC細胞的生存期，長時間保持DC細胞的活性。

本發明的技術方案為，該DC細胞與CIK細胞的共培養方法，由如下步驟組成：?1）提取單個核細胞、2）CIK細胞培養、3）DC細胞培養、4）DC細胞和CIK細胞混合培養、5）擴增培養；

其中，步驟4）DC細胞和CIK細胞混合培養具體操作如下：

4.1）將培養瓶中的DC培養基混勻后，轉移至無菌離心管；然后向培養瓶中加入10ml經4?℃預冷的生理鹽水，晃動培養瓶，并用10ml?移液管吹打瓶底的細胞，完畢后將培養瓶內液體移至無菌離心管，最終在離心管中得到用生理鹽水懸浮的DC細胞，即DC細胞懸液；

4.2）將收集好的DC細胞懸液在離心機內，室溫條件下離心10~20分鐘；離心，棄上清液，繼續用生理鹽水重懸細胞，獲得一次重懸細胞液，并對一次重懸細胞液進行取樣計數；

4.3）從層流室的4℃冰箱中取出培養基，靜置待培養基恢復至37℃；將步驟4.2）重懸細胞液進行離心，離心后棄上清液，用10ml??培養基重懸細胞，獲得二次重懸細胞液，并對二次重懸細胞液進行取樣計數；

4.4）吸取1.0×106個DC細胞、1.0×108個CIK細胞，在添加有培養基的培養體系中混合培養，培養體系為50ml?；按照50?~100ng/ml的濃度向培養體系中補加2500?ng~5000ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、體積分數5~6%?的CO₂培養箱繼續培養；培養12小時后，再次添加2500ng~5000ng的因子GM-CSF，置于37℃、體積分數5~6%?的CO₂培養箱繼續培養。

優選的，所述步驟1）提取細胞采用如下操作：

1.1）轉移外周血：采集患者50~80ml?外周血，并轉移到無菌離心管中，平均每管20~40ml??；

1.2）鋪層加樣：將血樣與生理鹽水按1：1的體積比混合均勻，并緩慢加入盛有室溫的5~20ml?人淋巴細胞分離液的無菌離心管中，配平后進行離心；?

1.3）提取單個核細胞：離心完畢后，離心管內出現分層，吸取血漿生理鹽水層棄之，直至距白膜層5毫米處；將紅細胞層之上的所有液體轉移至無菌離心管中，按細胞懸液與生理鹽水體積比1：1向無菌離心管中補充生理鹽水，混勻；

1.4）洗滌Ⅰ：將步驟1.3）無菌離心管中所得的細胞進行離心，棄上清液，用生理鹽水重懸細胞，混勻；

1.5）洗滌Ⅱ：將所得細胞收集到一支離心管中，加生理鹽水至50ml?，充分混勻，離心，棄上清液；

1.6）洗滌Ⅲ：將所得細胞收集到一支離心管中，補生理鹽水至40ml?，充分混勻，取樣計數，離心，棄上清液，即得提取獲得外周血單個核細胞。