[發明專利]一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突變體的方法

在審

• 申請號: 201410725610.8
• 申請日: 2014-12-05
• 公開（公告）號: CN104630343A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 高廣勛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及血液病分子生物學領域，尤其涉及一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪接突變體的方法。

背景技術

慢性粒細胞白血病是造血組織的惡性腫瘤，BCR/ABL融合基因及其不同突變體的檢測是該病診斷、病情監測、預后及指導治療的一個關鍵指標。目前的檢測方式很難同時檢測該基因的不同突變體，大多只能檢測其中一個基因，且檢出率低，耗費時間較長。

因此，現有技術有待于改進。

發明內容

本發明為了解決現有技術的不足，提供一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，采用多重巢式PCR方法，短時間內快速檢測出BCR/ABL融合基因及其不同突變體。

為解決上述技術問題，本發明實施例提供的一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，采用如下技術方案：

一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)A液：特異性逆轉錄引物

引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀釋混勻，濃度為2.5pmol/μl；

B液：巢式第一輪PCR反應液500μl(20測試)：

包含引物為：BCR-1、BCR-3、ABL-1、E2A-1、E2A-3；

第一輪多重PCR引物100pmol/條，緩沖體系為：Tris-HCL(PH8.3)8.8MM、KCL?44MM、dNTPs?0.16MM/each、MgCL₂1.32MM。儲存于-20℃，備用；

C液：巢式第二輪PCR反應液500μl(20測試)：

包含引物為：BCR-2、BCR-4、ABL-2、E2A-2、E2A-4；

各組第二輪多重PCR引物125pmol/條，反應緩沖體系為：Tris-HCL(PH?8.3)9.6MM、KCL?48MM、dNTPs?0.192MM/each、MgCL₂1.44MM，儲存于-20℃，

D液：陰性對照(陽性內對照)健康人外周血單個核細胞cDNA溶液，

E液：陽性對照-BCR/ABL?b3a2陽性K562細胞系cDNA溶液，

F液：陽性對照-BCR/ABL?e1a2陽性患者cDNA溶液，

G液：陽性對照-BCR/ABL?b2a2陽性患者cDNA溶液；

(2)采用廣泛表達的轉錄因子增強子結合因子基因(E2A)的mRNA作為陽性內對照；

(3)巢式第一輪PCR(25μl體系)：各取患者cDNA、陰性對照D液和陽性對照E液2μl，各取B液22ul，Taq?DNA聚合酶0.5μl(1.25U)，PCR條件為：95℃5min后，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，共30個循環，結束反應；

(4)巢式第二輪PCR(25ul體系)：各取C液22μl，相應的第1輪PCR產物2μl，Taq?DNA聚合酶0.5μl(1.25U)。PCR反應條件同第一輪。

本發明提供的一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，采用特異性的反轉錄引物，提高轉錄效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，較短時間內快速檢測出BCR/ABL融合基因及其不同突變體，為疾病的早期診斷及靶向治療提供依據。

附圖說明

圖1為BCR/ABL融合基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳EB染色后紫外燈下成像結果。

具體實施方式

下面結合本發明實施例提供的快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因的方法進行詳細描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)A液：特異性逆轉錄引物

引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀釋混勻，濃度為2.5pmol/μl，

B液：巢式第一輪PCR反應液500μl(20測試)：

包含引物為：BCR-1，BCR-3，ABL-1，E2A-1，E2A-3，

第一輪多重PCR引物100pmol/條，緩沖體系為：Tris-HCL(ph?8.3)8.8MM、KCL?44MM、dNTPs?0.16MM/each、MgCL₂1.32MM。儲存于-20℃，備用，

C液：巢式第二輪PCR反應液500μl(20測試)：