[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突變體的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410725610.8
• 申請(qǐng)日: 2014-12-05
• 公開（公告）號(hào): CN104630343A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高廣勛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

1.一種快速檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因及其不同剪接突變體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)A液：特異性逆轉(zhuǎn)錄引物

引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀釋混勻，濃度為2.5pmol/μl(引物序列見表1)；

B液：巢式第一輪PCR反應(yīng)液500μl(20測(cè)試)：

包含引物為：BCR-1、BCR-3、ABL-1、E2A-1、E2A-3；(引物序列見表2)

第一輪多重PCR引物100pmol/條，緩沖體系為：Tris-HCL(PH8.3)8.8MM、KCL?44MM、dNTPs?0.16MM/each、MgCL2?1.32MM，儲(chǔ)存于-20℃，備用。

C液：巢式第二輪PCR反應(yīng)液500μl(20測(cè)試)：

包含引物為：BCR-2、BCR-4、ABL-2、E2A-2、E2A-4；(引物序列見表2)

各組第二輪多重PCR引物125pmol/條，反應(yīng)緩沖體系為：Tris-HCL(PH?8.3)9.6MM、KCL?48mm、dNTPs?0.192MM/each、MgCL₂?1.44MM，儲(chǔ)存于-20℃，備用。

D液：陰性對(duì)照(陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照)健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞cDNA溶液；

E液：陽(yáng)性對(duì)照-BCR/ABL?b3a2陽(yáng)性K562細(xì)胞系cDNA溶液；

F液：陽(yáng)性對(duì)照-BCR/ABL?e1a2陽(yáng)性患者cDNA溶液；

G液：陽(yáng)性對(duì)照-BCR/ABL?b2a2陽(yáng)性患者cDNA溶液；

(2)采用廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)子結(jié)合因子基因(E2A)的mRNA作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照；

(3)巢式第一輪PCR(25μl體系)：各取患者cDNA、陰性對(duì)照D液和陽(yáng)性對(duì)照E液2μl，各取B液22μl，Taq?DNA聚合酶0.5μl(1.25U)，PCR條件為：95℃5min后，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，共30個(gè)循環(huán)，結(jié)束反應(yīng)；

(4)巢式第二輪PCR(25μl體系)：各取C液22μl，相應(yīng)的第1輪PCR產(chǎn)物2μl，Taq?DNA聚合酶0.5μl(1.25U)。PCR反應(yīng)條件同第一輪。