[發明專利]一種p53蛋白的電子介體型酶促電化學免疫檢測方法

在審

• 申請號: 201410724706.2
• 申請日: 2014-12-03
• 公開（公告）號: CN104483489A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 王曉英
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明涉及一種p53蛋白的檢測方法。

背景技術

p53蛋白，系人類腫瘤相關性最高基因p53的表達產物，是一種最具代表性的重要腫瘤相關蛋白。人體正常細胞中存在的p53蛋白量很低，這些低含量的p53蛋白極易被水解，且半衰期很短，僅有10-20分鐘的，一般難以覺察。p53蛋白的傳統檢測方法是免疫分析法，如放射免疫分析(RIA)、免疫組織化學法(IHC)及酶聯免疫分析(ELISA)等。RIA方法具有放射污染性，不易在臨床推廣。IHC法僅見應用于組織標本和細胞標本中p53蛋白表達的研究，其操作程序復雜，所需時間較長。ELISA是目前最常用的方法，其既可定性診斷又可定量診斷，同時可測定的標本數量很大；但其標記過程復雜、時間長，所需免疫試劑多，易引入隨機誤差且檢測信號放大程度有限。后又發展了流式熒光技術(xMAP)和組織微陣列技術(TMA)檢測p53蛋白，但其儀器投入費用和耗材較貴。p53蛋白的新的、便捷有效的檢測手段或方法是目前的前沿熱點課題。

電子介體型的酶促電化學免疫傳感器屬電化學免疫傳感器，其既具有電化學分析法的簡單快速、靈敏度高、成本低、不受樣品顏色和濁度的影響及所需儀器設備簡單，又具有免疫分析的高選擇性和專一性，協同酶促電子介體有效放大檢測信號，其受到眾多研究者的廣泛關注。但應用電子介體型的酶促電化學免疫傳感器檢測腫瘤蛋白p53國內外卻罕見相關報道。僅見Yuehe?Lin等分別應用石墨烯-殼聚糖、納米金修飾的絲網印刷碳電極結合單體硫堇-辣根過氧化物酶-H₂O₂模型體系構建電子介體型的酶促電化學免疫傳感器先后檢測了磷酸化的p53(S15)和(S392)。因臨床實際樣品組成復雜，其中p53蛋白濃度極低且不能進行直接擴增，現有方法很難實現實際樣品中p53蛋白的特異性檢測；如何進一步有效提高檢測方法的靈敏度是亟待解決的關鍵問題。

納米纖維是指直徑為納米尺度而長度較大的線狀材料。除具有納米材料的基本特性外，還具有極高的長徑比、孔隙率高、生物相容性較好、結構豐富、精細程度與均一性高、持久耐用及易于修飾再加工等優點，是一種潛在的具有廣闊應用前景的生物分子固定化載體材料。將納米纖維與酶促電子介體有效結合，用于構建電子介體型的酶促電化學免疫傳感器國內外未見相關報道，應用其特異性、高靈敏檢測腫瘤蛋白p53，是值得人們研究的重要課題。

發明內容

發明目的：針對p53蛋白的傳統檢測方法的不足，本發明提供了一種通過構建電子介體型酶促電化學免疫分析系統進行定量檢測p53蛋白的方法。

技術方案：本發明所述的p53蛋白的電子介體型酶促電化學免疫檢測方法，按以下步驟進行：

(1)制備免疫分子固定化活性界面：

將尼龍6與羧基化多壁碳納米管MWCNTs溶解于1:1～19:1,v/v的間甲酚/甲酸的混合溶劑中形成復合納米纖維PA6-MWCNTs混合物，再將該混合物在室溫下連續攪拌，制得前驅體靜電紡絲溶液；

將前驅體靜電紡絲溶液置于注射器中，高壓靜電發生器的正極連接注射器針頭，負極連接在裸電極上，采用微量注射泵供液，由高壓靜電發生器產生的高壓靜電直接施加在注射器針頭上，復合納米纖維PA6-MWCNTs收集于裸電極上，形成復合納米纖維PA6-MWCNTs修飾電極；

將復合納米纖維PA6-MWCNTs修飾電極浸于含有硫堇單體的聚合液中，對聚合液加以攪拌，攪拌速率為550～650r/min，溫度為28～32℃。先對此修飾電極施加電壓進行陽極化處理，然后進行循環伏安掃描，最后修飾電極用磷酸緩沖溶液PBS洗去吸附在修飾電極上的硫堇單體，形成聚硫堇功能化的復合納米纖維PA6-MWCNTs-PTH修飾電極，即獲得PA6-MWCNTs-PTH免疫分子固定化活性界面。該PA6-MWCNTs-PTH免疫分子固定化活性界面，在磷酸緩沖液中保存2天后，電流響應幾乎不變。

(2)構建電子介體型酶促電化學免疫分析系統：