[發明專利]一種p53蛋白的電子介體型酶促電化學免疫檢測方法

在審

• 申請號: 201410724706.2
• 申請日: 2014-12-03
• 公開（公告）號: CN104483489A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 王曉英
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種p53蛋白的電子介體型酶促電化學免疫檢測方法，其特征在于所述的檢測方法按以下步驟進行：

(1)制備免疫分子固定化活性界面：以尼龍6與羧基化多壁碳納米管為原料經靜電紡絲、電聚合硫堇得到聚硫堇功能化的復合納米纖維PA6-MWCNTs-PTH修飾電極；

(2)構建電子介體型酶促電化學免疫分析系統：

將步驟(1)所得的PA6-MWCNTs-PTH修飾電極與捕獲抗體Ab₁溫育，電極經PBS溶液清洗，除去電極表面非特異性吸附的Ab₁，然后浸入含巰基乙醇的牛血清蛋白中放置，以封被電極表面未被捕獲抗體覆蓋的活性位點，得到捕獲抗體修飾電極；

將所述的捕獲抗體修飾電極與檢測腫瘤蛋白p53溫育，電極經PBS溶液清洗，得到檢測腫瘤蛋白p53電極；

將所述的檢測腫瘤蛋白p53電極與HRP標記的檢測抗體HRP@Ab₂溫育，電極經PBS溶液清洗，獲得三明治Ab₁-AG_p53-HRP@Ab₂復合物修飾電極；

將所述三明治Ab₁-AG_p53-HRP@Ab₂復合物修飾電極作為工作電極，Ag/AgCl或飽和KCl電極作為參比電極，Pt絲電極作為對電極，構成三電極體系，經所述三電極體系構建電子介體型酶促電化學免疫分析系統；

(3)p53蛋白定量檢測：

采用步驟(2)得到的分析系統，結合標準曲線對p53蛋白進行定量檢測；所述標準曲線是以系列p53蛋白標準溶液的濃度為橫坐標，差分脈沖伏安法差值為縱坐標繪制標準曲線；其中DPV強度差值是p53蛋白的DPV強度減去空白液的DPV強度。

2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(1)在電聚合硫堇過程中對聚合液加以攪拌和控溫，攪拌速率為550～650r/min，溫度為28～32℃。

3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中第一次溫育體系含乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽。

4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中含巰基乙醇的牛血清蛋白濃度為1wt％，其中含有0.1wt％巰基乙醇。

5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)中電極浸入含巰基乙醇的牛血清蛋白中放置時間為30min，溫度為室溫。

6.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中的三次溫育溫度均為37℃，溫育時間均為50min。

7.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中構建的電子介體型酶促電化學免疫分析系統主要參數設置為：電位掃描范圍-0.4～+0.15V，振幅0.05V，脈沖寬度0.05s，脈沖周期0.2s；檢測液為0.1M?PBS含4.0mmol/L?H₂O₂，pH值為6.0。

8.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述免疫分子固定化活性界面制備步驟為：將尼龍6與羧基化多壁碳納米管溶解于1:1～19:1,v/v的間甲酚/甲酸的混合溶劑中形成PA6-MWCNTs混合物，再將該混合物在室溫下連續攪拌，制得前驅體靜電紡絲溶液；

將前驅體靜電紡絲溶液置于注射器中，高壓靜電發生器的正極連接注射器針頭，負極連接在裸電極上，采用微量注射泵供液，由高壓靜電發生器產生的高壓靜電直接施加在注射器針頭上，復合納米纖維PA6-MWCNTs收集于裸電極上，形成復合納米纖維PA6-MWCNTs修飾電極；

將復合納米纖維PA6-MWCNTs修飾電極浸于含有硫堇單體的聚合液中，先對此修飾電極施加電壓進行陽極化處理，然后進行循環伏安掃描，最后修飾電極用磷酸緩沖溶液PBS洗去吸附在修飾電極上的硫堇單體，形成聚硫堇功能化的復合納米纖維PA6-MWCNTs-PTH修飾電極，即獲得PA6-MWCNTs-PTH免疫分子固定化活性界面。

9.如權利要求1或8所述的檢測方法，其特征在于所述的PBS溶液濃度為10mmol/L?pH值為7.2，其中含有10mmol/L?K⁺、2mmol/L?Mg²⁺、1mmol/L巰基乙醇和1mmol/L?ATP。

10.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于聚硫堇功能化的復合納米纖維PA6-MWCNTs-PTH既作為免疫分子固定化活性界面用于捕獲Ab₁有效提高免疫分子的固載量，同時又作為電子介體經PTH-HRP-H₂O₂放大電學檢測信號。