[發明專利]一種利用腸桿菌生產耐低溫β-甘露聚糖酶的方法

在審

• 申請號: 201410723219.4
• 申請日: 2014-12-02
• 公開（公告）號: CN104531638A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 牟伯中;楊世忠;劉金峰;剛洪澤;尤佳
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

技術領域

本發明涉及一種生產β-甘露聚糖酶的方法，具體涉及利用腸桿菌發酵培養生產耐低溫β-甘露聚糖酶的方法。

背景技術

半纖維素是地球上第二大資源，甘露聚糖作為半纖維素的一個主要組成部分有著極大的開發價值。甘露聚糖資源的開發和利用需要用到甘露聚糖酶。隨著人們對甘露聚糖資源的開發，β-甘露聚糖酶在食品、醫藥、造紙、飼料、紡織印染、石油開采等工業領域都有著廣泛的發展空間。

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mananmannohydrolase；EC?3.2.1.78)能夠水解含有β-1，4-D-甘露糖苷鍵的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等)。β-甘露聚糖酶來源廣泛，包括動物、植物、細菌、放線菌、真菌等，其中又主要以微生物來源為主。雖然β-甘露聚糖酶的需求量不斷增大，但是實際上它在各行業中的應用現狀與其重要性相差甚遠。原因在于微生物生產β-甘露聚糖酶的產量較低、酶活性較小、強制生產無疑導致生產成本過高。所以降低β-甘露聚糖酶的生產成本、提高酶的活性是使β-甘露聚糖酶能夠得到大規模應用的前提。

目前，國內外關于利用微生物生產β-甘露聚糖酶的報道很多，包括枯草芽孢桿菌、黑曲霉、地衣芽孢桿菌、毛殼菌等等，但是這些菌的野生菌株產β-甘露聚糖酶的活性普遍較低。短小芽孢桿菌XZG33產β-甘露聚糖酶粗酶液比活僅達到46.3U/mg(以刺槐豆膠為底物)，且培養基中需分別加入1％(wt％)的蛋白胨和酵母粉，大大提高了成本，經純化后比活方可達到1838.2U/mg，但酶活依然較低，且純化處理的成本過高(高兆建，唐仕榮，孫會剛，et?al.短小芽孢桿菌XZG33耐高溫酸性β-甘露聚糖酶酶學性質研究[J].安徽農業科學，2010，38(18)：9396-9399)。中國發明專利CN?102732494A公開了一種將毛殼菌產甘露聚糖酶的基因在畢赤酵母中高效表達的方法，但其在5L發酵罐中發酵，產酶比活才能達到8201U/mg(以刺槐豆膠為底物)，此外，由于發酵時需要采用畢赤酵母專用培養基BMGY(包含質量分數為1％的酵母粉，2％的蛋白胨，1.34％的YNB，微量元素以及1％的甘油)，成分復雜，成本高。中國發明專利CN?102433267A中也公開了一種利用重組酵母發酵產β-甘露聚糖酶的方法，在高成本的BMGY培養基下發酵，誘導時間長達84小時時酶活方能達到6336U/mL(以槐豆膠為底物)。中國發明專利CN101016531?A中公開了一種中性β-甘露聚糖酶的生產方法，其利用枯草芽孢桿菌TQS6發酵產β-甘露聚糖酶，發酵液中酵母膏和蛋白胨的需求量同樣高達10g/L，此外仍需加入魔芋降解液、豆粕粉、玉米渣等多種碳源，連續發酵后酶活才能達到1500-1600U/mL(以魔芋粉為底物)。

另一方面，如今大多數已報道的微生物產β-甘露聚糖酶多為中溫酶，最適溫度范圍較窄，尤其在低溫領域，關于耐低溫β-甘露聚糖酶的報道僅有5篇。這5種β-甘露聚糖酶分別來源于黑曲霉(Aspergillus?niger)，地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)，黃桿菌(Flavobacterium?sp.)，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)以及一種南極跳蟲(Cryptopygus?antarcticus)。但它們所產的酶經純化后在20℃下以刺槐豆膠為底物檢測，比活僅分別為398.7U/mg，74.5U/mg，1.5U/mg，69.4U/mg和416.3U/mg。

本發明提供了一種利用腸桿菌生產耐低溫β-甘露聚糖酶的方法，克服了現有技術生產β-甘露聚糖酶比活低、純化成本高、低溫活性差等缺陷。僅利用搖瓶培養其酶活可達7260U(以刺槐豆膠為底物)，培養基成分簡單，成本低，且該酶能在10min內將粘度超過800mPa·s的1.4％的瓜爾膠溶液粘度降低95％以上，降粘效率高。該酶的最適反應條件為50℃，pH7.5，但在0～100℃，pH3.0～11.0，NaCl含量0～4.5M范圍內均保有活性，20℃下比活依然保持在50％以上。目前，未見關于腸桿菌生產β-甘露聚糖酶的報道。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種比活高、純化成本低、低溫活性高的利用腸桿菌生產耐低溫β-甘露聚糖酶的方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：一種利用腸桿菌生產耐低溫β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，該方法是將腸桿菌(Enterobacter?sp.N18)接種于含有碳源、氮源的培養基中，37℃，培養12～96h，所得發酵液即為β-甘露聚糖酶產品。