[發(fā)明專利]一種基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺@殼聚糖復(fù)合膠束的免疫傳感器的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410721208.2
• 申請(qǐng)日: 2014-12-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104407140A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉曉亞;許升;張榮莉;羅靜;張翠歌;趙鑫犇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/574
• 分類號(hào): G01N33/574;G01N27/327
• 代理公司: 無(wú)錫華源專利事務(wù)所(普通合伙) 32228
• 代理人: 馮智文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及電化學(xué)傳感器領(lǐng)域，尤其是涉及一種采用大分子膠束—γ-聚谷氨酸接枝多巴胺@殼聚糖復(fù)合膠束修飾的電極，并將其制備成電化學(xué)免疫傳感器的方法。

背景技術(shù)

2014年2月4日是“世界癌癥日”，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表了《全球癌癥報(bào)告2014》，研究稱2012年全球癌癥患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國(guó)，中國(guó)新增癌癥病例高居第一位；報(bào)告預(yù)測(cè)全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，由2012年的1400萬(wàn)人，逐年遞增至2025年的1900萬(wàn)人，到2035年將達(dá)到2400萬(wàn)人。

臨床上對(duì)于癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原(CA125、CA19-9)等腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，對(duì)結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性惡性腫瘤等的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)具有重要參考價(jià)值。目前檢測(cè)血清中腫瘤標(biāo)志物的免疫分析方法有多種，如放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法和脂質(zhì)體免疫分析法等，然而，這些方法具有輻射危害、背景噪音信號(hào)大、繁瑣復(fù)雜的清洗過(guò)程、分析時(shí)間長(zhǎng)、儀器貴重和需要專業(yè)操作人員等缺點(diǎn)。

電化學(xué)免疫傳感器是將高靈敏的傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，用以監(jiān)測(cè)抗原-抗體(Antigen-Antibody)反應(yīng)的一種新型生物傳感器，它既具有電化學(xué)傳感器的高靈敏度和簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，又具有免疫分析的高特異性、強(qiáng)專一性和低檢出限等優(yōu)點(diǎn)。

大分子自組裝是指大分子間通過(guò)非共價(jià)鍵作用而自發(fā)形成熱力學(xué)穩(wěn)定且具有明確有序結(jié)構(gòu)的聚集體的過(guò)程。自組裝的驅(qū)動(dòng)力包括具有可逆性和選擇性的氫鍵、靜電作用、親疏水作用、范德華力、金屬配位作用以及能夠可逆形成和破壞的共價(jià)鍵等作用力。通過(guò)自組裝技術(shù)可制備形態(tài)豐富、功能迥異的大分子膠束，這種自組裝膠束在許多高新技術(shù)領(lǐng)域如藥物緩釋、細(xì)胞顯影、生物催化、納米反應(yīng)器、污水處理、化學(xué)傳感器等具有很好的應(yīng)用前景。

構(gòu)建免疫傳感器的關(guān)鍵在于抗體的固定技術(shù)(固定量)，因此免疫傳感器修飾材料應(yīng)具有比表面積大、活性位點(diǎn)多、非特異性吸附能力小、能很好的保持生物大分子活性等性質(zhì)，傳統(tǒng)修飾材料有殼聚糖等天然大分子、納米碳基材料、納米介孔無(wú)機(jī)納米粒子、量子點(diǎn)等。然而，將大分子自組裝膠束與生物分析技術(shù)結(jié)合構(gòu)建新型、多樣化電化學(xué)傳感器，有望廣泛應(yīng)用于食品安全、生物醫(yī)藥及環(huán)保監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺@殼聚糖復(fù)合膠束的免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明傳感器采用的大分子膠束具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，本發(fā)明傳感器對(duì)于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)具有靈敏度高、檢測(cè)限低、檢測(cè)范圍寬、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于γ-聚谷氨酸接枝多巴胺@殼聚糖復(fù)合膠束的免疫傳感器的制備方法，大分子膠束的制備、大分子膠束修飾電極的制備、免疫傳感器的構(gòu)建的具體步驟如下：

(1)大分子膠束的制備

將殼聚糖(CS)溶液逐滴加入到40～50倍其體積的γ-聚谷氨酸接枝多巴胺(γ-PGA-g-DA)溶液中，以500～1000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，使殼聚糖與γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液通過(guò)靜電作用自組裝形成大分子膠束，繼續(xù)以500～1000rpm的轉(zhuǎn)速速攪拌5h～12h，使膠束聚合物組裝完全；將所得大分子膠束溶液通過(guò)孔隙800nm的針式過(guò)濾器，得到粒徑均勻分布的大分子膠束溶液即γ-聚谷氨酸接枝多巴胺@殼聚糖復(fù)合膠束(γ-PGA-g-DA@CS)溶液；

(2)大分子膠束修飾電極的制備

將所述大分子膠束溶液通過(guò)滴涂、電泳沉積的方法修飾在傳感電極表面，形成粒子膜，室溫晾干，制得大分子膠束修飾電極；

所述電極為金電極、鉑電極、玻碳電極或ITO玻璃電極；

(3)免疫傳感器的構(gòu)建

將制得的大分子膠束修飾電極浸入氯金酸水溶液中，通過(guò)恒電位還原氯金酸在電極表面修飾納米金粒子；再將納米金修飾的電極浸入含抗體的磷酸鹽緩沖溶液中與抗體結(jié)合；最后將結(jié)合抗體的電極浸入牛血清蛋白溶液中以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，即制得免疫傳感器。

所述步驟(1)中殼聚糖溶液的濃度0.5mg/mL～1.0mg/mL，溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％～5％的醋酸水溶液或鹽酸水溶液；γ-聚谷氨酸接枝多巴胺溶液的濃度0.05mg/mL～0.5mg/mL，溶劑為去離子水或超純水。

所述步驟(2)中電極在使用前需經(jīng)預(yù)處理，預(yù)處理的方法為：