[發明專利]小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑靶標抗性的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201410720320.4
• 申請日: 2014-12-01
• 公開（公告）號: CN105624278B
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 吳益東;王興亮;楊亦樺;武淑文
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑靶標抗性的分子檢測方法。該方法利用SEQ ID NO.1所示的特異性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特異性反向引物R對小菜蛾基因組DNA模板進行PCR擴增，對PCR純化產物直接測序，根據測序色譜圖鑒定小菜蛾個體鈉離子通道在編碼1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突變及其具體類型，一次性區分出所述鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子。該方法具有快速簡便、準確性高的優點，專用于小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑(茚蟲威和氰氟蟲腙)抗性的監測和預警。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑靶標抗性的分子檢測方法，專用于小菜蛾對鈉離子通道阻斷類殺蟲劑(Sodium Channel BlockingInsecticides，簡稱SCBIs，包括茚蟲威和氰氟蟲腙)靶標抗性的高靈敏度快速檢測。

技術背景

小菜蛾作為世界性十字花科蔬菜和油菜害蟲，全球每年造成的損失和防治費用高達40～50億美元。十字花科蔬菜是世界各國食用蔬菜的主要來源，與人們日常生活息息相關；油菜是各國重要的油料作物，事關食用油產量安全。20世紀80年代中后期以來，小菜蛾在我國持續大面積暴發成災，據統計近年來我國蔬菜種植面積接近3億畝/年，已是世界第一大蔬菜種植和生產國，因小菜蛾為害造成的蔬菜減產和治理費用極其高昂。在長期的殺蟲劑選擇壓力作用下，小菜蛾已對至少92種殺蟲活性成分產生了不同程度的抗藥性，幾乎涵蓋了所有用于其防治的殺蟲劑。我國田間小菜蛾抗藥性發展速度極快，并導致蔬菜農藥殘留超標嚴重威脅農產品質量安全，小菜蛾抗藥性治理形勢十分嚴峻。

茚蟲威是由美國杜邦公司20世紀末開發的第一個商品化的鈉離子通道阻斷型殺蟲劑，已在中國、澳大利亞、美國等多個國家作為優良的候選殺蟲劑登記注冊。茚蟲威在昆蟲體內迅速轉化為N-去甲氧碳基代謝物，它能更有效抑制電壓門控鈉通道進而阻斷神經沖動傳導。經過十多年使用，一些地區種群對茚蟲威的抗性逐漸顯現，部分使用較多地區的小菜蛾種群對其已產生極高水平抗性。氰氟蟲腙是德國巴斯夫公司和日本農藥公司聯合開發的一種全新的化合物，其不需要生物激活本身具有殺蟲活性，也屬于神經元鈉離子通道阻斷劑。目前，昆蟲中報道甜菜夜蛾對氰氟蟲腙產生了較強的抗藥性。茚蟲威和氰氟蟲腙同屬鈉離子通道阻斷類殺蟲劑，而鈉離子通道基因突變是導致抗性產生的最主要原因。

至今，國內外尚未建立昆蟲對SCBIs類殺蟲劑抗性的分子檢測方法，基于該靶標基因的分子檢測技術均集中在DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑相關的突變位點。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中小菜蛾對鈉離子通道阻斷類殺蟲劑抗性檢測方法靈敏度低、周期長、材料要求高等問題，根據我們對小菜蛾SCBIs類殺蟲劑抗藥性機理的研究，提供小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑靶標抗性的分子檢測方法。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

一種小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的分子檢測方法，所述的鈉離子通道阻斷劑為茚蟲威和氰氟蟲腙，利用SEQ ID NO.1所示的特異性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特異性反向引物R對小菜蛾基因組DNA模板進行PCR擴增，對PCR純化產物直接測序，根據測序色譜圖鑒定小菜蛾個體鈉離子通道編碼1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突變及其具體類型，一次性區分出所述鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子。

本發明涉及的小菜蛾野生型鈉離子通道基因cDNA序列全長5850bp(GenBank登錄號為KM027335)，我們研究發現：敏感型序列ROTH-S第5534位核苷酸由T突變為A(附圖1：SCBIs-R2，GenBank登錄號為KM027337)，其編碼的蛋白質由F突變為Y，將導致小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑茚蟲威和氰氟蟲腙產生抗性；敏感型序列ROTH-S第5542位核苷酸由G突變為A(附圖1：SCBIs-R1，GenBank登錄號為KM027336)，其編碼的蛋白質由V突變為I，將導致小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑茚蟲威和氰氟蟲腙產生抗性。