[發明專利]小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑靶標抗性的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201410720320.4
• 申請日: 2014-12-01
• 公開（公告）號: CN105624278B
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 吳益東;王興亮;楊亦樺;武淑文
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的分子檢測方法，所述的鈉離子通道阻斷劑為茚蟲威和氰氟蟲腙，其特征在于利用SEQ ID NO.1所示的特異性正向引物F和SEQ IDNO.2所示的特異性反向引物R對小菜蛾基因組DNA模板進行PCR擴增，對PCR純化產物直接測序，根據測序色譜圖鑒定小菜蛾個體鈉離子通道編碼1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突變及其具體類型，一次性區分出所述鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子；所述的根據測序色譜圖鑒定小菜蛾個體鈉離子通道編碼1845和1848位氨基酸的密碼子是否突變及其具體類型，一次性區分出所述鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子為：色譜圖中識別序列前一位為T單峰、識別序列后一位為G單峰，則表明該小菜蛾個體為不攜帶鈉離子通道1845和1848位氨基酸突變的鈉離子通道阻斷劑敏感純合子；色譜圖中識別序列前一位為T/A雙峰、識別序列后一位為G單峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1845位氨基酸由F突變為Y的鈉離子通道阻斷劑抗性雜合子；色譜圖中識別序列前一位為A單峰、識別序列后一位為G單峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1845位氨基酸由F突變為Y的鈉離子通道阻斷劑抗性純合子；色譜圖中識別序列前一位為T單峰、識別序列后一位為G/A雙峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1848位氨基酸由V突變為I的鈉離子通道阻斷劑抗性雜合子；色譜圖中識別序列前一位為T單峰、識別序列后一位為A單峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1848位氨基酸由V突變為I的鈉離子通道阻斷劑抗性純合子；色譜圖中識別序列前一位為T/A雙峰、識別序列后一位為G/A雙峰，則表明該小菜蛾個體為同時攜帶1845位氨基酸由F突變為Y和 1848位氨基酸由V突變為I雙突變的鈉離子通道阻斷劑抗性雜合子；色譜圖中識別序列前一位為A單峰、識別序列后一位為A單峰，則表明該小菜蛾個體為同時攜帶1845位氨基酸由F突變為Y和 1848位氨基酸由V突變為I雙突變的鈉離子通道阻斷劑抗性純合子；其中，所述的識別序列為5′-CCTCATC-3′。

2.根據權利要求1所述的分子檢測方法，其特征在于該方法包含以下步驟：

（1）提取單頭小菜蛾幼蟲或成蟲的基因組DNA；

（2）利用SEQ ID NO.1所示的特異性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特異性反向引物R，對上一步提取的小菜蛾基因組DNA進行PCR擴增；

（3）將上一步獲得的PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，對目的片段純化回收后進行直接測序，測序引物為SEQ ID NO.2所示的引物R，通過檢測編碼1845和1848位氨基酸的核苷酸測序色譜圖，一次性區分在這兩個位點分別或同時攜帶所述鈉離子通道阻斷劑抗性基因的個體。

3.根據權利要求1～2中任一項所述的分子檢測方法，其特征在于，以12.5ul 2×GCBuffer I， 1.25U LA Taq DNA聚合酶, 1μl單頭小菜蛾樣本的基因組DNA，1μl 10mMdNTPs，10mM的引物各1μl，加雙蒸水至反應總體積為25μl;PCR反應程序為：94℃預變性3min； 94℃變性30s，47℃退火30s，72℃延伸10min，35個循環。

4.SEQ ID NO.1所示的特異性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特異性反向引物R在分子檢測小菜蛾對鈉離子通道阻斷劑抗性靶標中的應用，所述的鈉離子通道阻斷劑為茚蟲威和氰氟蟲腙，其特征在于利用SEQ ID NO.1所示的特異性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特異性反向引物R對小菜蛾基因組DNA模板進行PCR擴增，對PCR純化產物直接測序，根據測序色譜圖鑒定小菜蛾個體鈉離子通道編碼1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突變及其具體類型，一次性區分出所述鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子；所述的根據測序色譜圖鑒定小菜蛾個體鈉離子通道編碼1845和1848位氨基酸的密碼子是否突變及其具體類型，一次性區分出所述鈉離子通道阻斷劑抗性靶標的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子為：色譜圖中識別序列前一位為T單峰、識別序列后一位為G單峰，則表明該小菜蛾個體為不攜帶鈉離子通道1845和1848位氨基酸突變的鈉離子通道阻斷劑敏感純合子；色譜圖中識別序列前一位為T/A雙峰、識別序列后一位為G單峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1845位氨基酸由F突變為Y的鈉離子通道阻斷劑抗性雜合子；色譜圖中識別序列前一位為A單峰、識別序列后一位為G單峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1845位氨基酸由F突變為Y的鈉離子通道阻斷劑抗性純合子；色譜圖中識別序列前一位為T單峰、識別序列后一位為G/A雙峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1848位氨基酸由V突變為I的鈉離子通道阻斷劑抗性雜合子；色譜圖中識別序列前一位為T單峰、識別序列后一位為A單峰，則表明該小菜蛾個體為攜帶1848位氨基酸由V突變為I的鈉離子通道阻斷劑抗性純合子；色譜圖中識別序列前一位為T/A雙峰、識別序列后一位為G/A雙峰，則表明該小菜蛾個體為同時攜帶1845位氨基酸由F突變為Y和 1848位氨基酸由V突變為I雙突變的鈉離子通道阻斷劑抗性雜合子；色譜圖中識別序列前一位為A單峰、識別序列后一位為A單峰，則表明該小菜蛾個體為同時攜帶1845位氨基酸由F突變為Y和 1848位氨基酸由V突變為I雙突變的鈉離子通道阻斷劑抗性純合子；其中，所述的識別序列為5′-CCTCATC-3′。