[發(fā)明專利]一種治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410720308.3
• 申請(qǐng)日: 2014-12-01
• 公開（公告）號(hào): CN104387475A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 覃啟紅;溫華杰;黃龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 覃啟紅
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61P31/20
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 黃為

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種融合蛋白，具體地說，是一種治療HPV?16和HPV?18病毒的融合蛋白，本發(fā)明該公開了該融合蛋白的制備方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

99％以上的宮頸癌是由人乳頭狀瘤病毒(HPV)引起。人乳頭狀瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是婦女患宮頸癌的主要原因。在118種HPV亞型中，共有14種高風(fēng)險(xiǎn)的HPV病毒株被認(rèn)為是造成宮頸癌及其癌前病變的高風(fēng)險(xiǎn)HPV亞型，其中兩種病毒株風(fēng)險(xiǎn)最高HPV?16和HPV?18，可導(dǎo)致70％-85％的宮頸癌病例。開發(fā)出針對(duì)HPV?16和HPV?18兩個(gè)型別的治療藥物對(duì)預(yù)防宮頸癌的發(fā)生有著重要意義。?

TALE蛋白N端和C端分別是核定位信號(hào)(Nuclear?loca?lizat?ion?signal，NLS)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation?domain，AD)，而中部則是介導(dǎo)其與DNA特異識(shí)別與結(jié)合的重復(fù)單位(或稱重復(fù)單元)構(gòu)成，重復(fù)單位的部分由長(zhǎng)度為33～35個(gè)氨基酸殘基的，在每個(gè)重復(fù)單位中，+12和+13位的氨基酸殘基是實(shí)現(xiàn)靶向識(shí)別特異DNA堿基的關(guān)鍵位點(diǎn)，隨靶點(diǎn)核苷酸序列的不同而異，被稱作重復(fù)可變雙殘基(Repeat?variable?di-residue，RVD)。不同的RVD能夠相對(duì)特異地分別識(shí)別A、T、C、G?4種堿基中的一種。ScPvuII限制性內(nèi)切酶是一種常見的限制性核酸內(nèi)切酶，特異的識(shí)別CAGCTG位點(diǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種制備方法簡(jiǎn)單，用于HPV?16和?HPV?18病毒的融合蛋白及其制備方法。?

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一個(gè)技術(shù)方案是這樣的：該治療HPV16和HPV?18病毒的融合蛋白，所述的融合蛋白TALEs-ScPvuII-HPV18基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；所述的融合蛋白TALEs-ScPvuII-HPV16_1-3的基因序列如SEQ?ID?NO：2，SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示。?

進(jìn)一步的，上述的治療HPV?16和HPV?18病毒的融合蛋白，所述的融合蛋白依次由下述方法制得：?

1)靶位點(diǎn)的篩選?

以HPV16的E6基因和E7基因，HPV18的E7基因?yàn)榘谢颍琓ALEs識(shí)別的位點(diǎn)加上限制性內(nèi)切酶ScPvuII的識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成TALEs-ScPvuII的靶位點(diǎn)；?

其中：?

HPV18的E7基因上的靶基因TALEs-ScPvuII-HPV18的靶位點(diǎn)為：?

TCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTG；?

HPV16的E6和E7基因TALEs-ScPvuII-HPV16的靶位點(diǎn)為：?

TCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTG，?

TAGGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTG，?

TGGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTG。?

2)PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV18和PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV16_1-3原核表達(dá)載體的構(gòu)建?

將TALEs-ScPvuII-HPV18和TALEs-ScPvuII-HPV16_1-3克隆到原核表達(dá)載體PET-16b的NdeI和BamHI位點(diǎn)，獲得TALEs-ScPvuI?I-HPV18和?

TALEs-ScPvuII-HPV16_1-3原核表達(dá)載體，最后同時(shí)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；?

3)TALEs-ScPvuI?I-HPV18和TALEs-ScPvuII-HPV16_1-3蛋白的表達(dá)與純化?

將帶有重組質(zhì)粒TALEs-ScPvuII-HPV18和TALEs-ScPvuI?I-HPV16_1-3的大腸桿菌BL21菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，在12-18℃經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)，分別收集所得到的?