[發(fā)明專(zhuān)利]一株脅迫條件下低蛋白酶A外泌的酵母菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410720237.7
• 申請(qǐng)日: 2014-12-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104630080B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳葉福;肖冬光;韓月然;郭學(xué)武;董健;張翠英;杜麗平;馬立娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/16
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/16;C12N15/81;C12C11/00;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/865
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

本發(fā)明提供了一種在脅迫條件下調(diào)節(jié)蛋白酶A胞內(nèi)外分泌的新方法，是通過(guò)過(guò)表達(dá)控制蛋白酶A從高爾基體向液泡分選的受體基因VPS10來(lái)實(shí)現(xiàn)的。過(guò)表達(dá)VPS10的菌株，胞內(nèi)酶活提高了1.47倍，而胞外酶活降低到出發(fā)菌株的61％，同時(shí)過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵特性并沒(méi)有明顯改變。本發(fā)明為降低蛋白酶A胞外酶活的同時(shí)不改變發(fā)酵特性提供了一種的新的思路和方法，對(duì)提高工業(yè)酵母泡沫穩(wěn)定性具有指導(dǎo)意義。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，特別是一株在發(fā)酵末期脅迫條件下適合低蛋白酶A外泌的酵母菌株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

在純生啤酒發(fā)展的過(guò)程中，一些有關(guān)純生啤酒的質(zhì)量問(wèn)題一直困擾著釀造工程師，其中純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性問(wèn)題尤為突出。由于純生啤酒在包裝前未經(jīng)過(guò)巴氏滅菌，在發(fā)酵末期，氮源不足，高的酒精和二氧化碳濃度會(huì)給酵母造成一個(gè)脅迫環(huán)境，導(dǎo)致蛋白酶A的外泌，分解泡沫陽(yáng)性蛋白，降低啤酒泡持性，對(duì)純生啤酒的泡沫質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。因此，提高純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性，成為當(dāng)今世界改善純生啤酒質(zhì)量的一個(gè)重大技術(shù)難題。

雖然，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，或者添加泡沫穩(wěn)定劑能夠從一定程度上改善啤酒泡沫穩(wěn)定性，但是這種方法都不能從源頭上解決泡沫衰減問(wèn)題?；蚬こ躺贤ㄟ^(guò)敲除產(chǎn)生蛋白酶A的基因PEP4來(lái)降低蛋白酶A外泌，從而使啤酒的穩(wěn)定性增加。但是，由于胞內(nèi)蛋白酶A對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的生理生化功能有很重要的作用，例如參與液泡內(nèi)多種酶的成熟和激活過(guò)程；影響細(xì)胞內(nèi)一些糖代謝酶的正常表達(dá)等。所以PEP4缺失菌株的發(fā)酵特性會(huì)受到胞內(nèi)蛋白酶A缺失的影響。

正常代謝條件下釀酒酵母蛋白酶A的分泌過(guò)程是，前蛋白酶A原(preproPrA)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，先經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修飾和折疊，再運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，最終被液泡分選受體定向運(yùn)輸至液泡并在液泡中形成成熟的蛋白酶A(PrA)。但是隨著發(fā)酵后期各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、氮源不足等脅迫條件下就會(huì)錯(cuò)誤地運(yùn)送到胞外，并在胞外被激活。

正常代謝條件下，VPS10作為編碼液泡分選受體的基因，在蛋白酶A從高爾基體向液泡定向分泌的過(guò)程中起著重要作用。當(dāng)?shù)鞍酌窤原前肽上的識(shí)別位點(diǎn)與分選受體特異性結(jié)合，蛋白酶A原從反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)被輸送至液泡，并在到達(dá)液泡后被激活，由54個(gè)氨基酸殘基組成的前肽被切除，最后形成分子量約42kD活性蛋白酶A。

然而，目前對(duì)于在脅迫條件下，通過(guò)調(diào)控液泡分選受體的表達(dá)量來(lái)控制蛋白酶A的內(nèi)外分泌的研究報(bào)道很少，尤其是在選育低蛋白酶A外泌的酵母菌株的 研究方面更是空白，因此，本發(fā)明通過(guò)設(shè)置一個(gè)氮源缺乏，并且高的酒精和二氧化碳濃度的脅迫環(huán)境，來(lái)模擬啤酒發(fā)酵后期的發(fā)酵條件，分別敲除和過(guò)表達(dá)VPS10基因，來(lái)調(diào)控液泡受體表達(dá)量，進(jìn)而選育出適合發(fā)酵的低產(chǎn)蛋白酶A菌株，這種方法對(duì)于提高啤酒泡沫穩(wěn)定性，尤其是純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性具有指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所述的調(diào)控蛋白酶A胞內(nèi)外分泌的新方法是通過(guò)過(guò)表達(dá)釀酒酵母出發(fā)菌株中編碼液泡分選受體的VPS10基因全序列，獲得低蛋白酶A釀酒酵母菌株。

所述VPS10基因其Gene ID為：852264，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選的，所述釀酒酵母出發(fā)菌株為模式菌株W303-1A；

所述低蛋白酶A分泌的釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)先將pPGK1質(zhì)粒上的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1p-PGK1t片段插入到Y(jié)EP352表達(dá)載體上，再將VPS10基因插入到啟動(dòng)子PGK1p和終止子PGK1T之間，最后將KanMX抗性標(biāo)記插入表達(dá)質(zhì)粒。

(2)將重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到出發(fā)菌株中,得到過(guò)表達(dá)VPS10的重組菌株WGV10。

具體如下：

(1)Yep-PVK質(zhì)粒的構(gòu)建